[发明专利]一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法

说明书

本发明公开了一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，具体包括以下步骤方法,S1、R1601‑hEGF菌株构建；S2、转hEGF花生毛状根的诱导与筛选；S3、转hEGF花生毛状根的摇瓶培养；S4、花生毛状根中hEGF的含量测定与蛋白特征分析。本发明通过花生毛状根技术实现高效安全表达hEGF，具有培养简便，培养成本低廉，hEGF含量高的优点，且宿主安全性高，具有较强的竞争优势。

技术领域

本发明涉及一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，本发明还涉及含有hEGF表达载体的侵染菌株构建方法以及利用该侵染菌株侵染花生叶片获得转hEGF花生毛状根的方法。

背景技术

人表皮生长因子(Human Epidemal Growth Factor，hEGF)可用于烧伤，美容，胃病治疗、角膜移植手术及肿瘤等方面的治疗和应用，具有巨大的经济效益和应用前景，目前许多国家已经批准hEGF作为基因工程药物进入I期临床试验或者成为商品。

现已通过不同的途径来分离和提取hEGF。而直接从组织中提取hEGF比较困难且产量低；化学合成hEGF存在产率低等问题，远远满足不了人们对hEGF的需求。而关于hEGF的转基因植物生产的报道主要集中在利用根癌农杆菌介导法进行转染烟草和番茄的研究，都不尽理想。植物毛状根表达系统作为药用蛋白生物反应器具有成本低廉，易于规模化生产，与人无交叉感染，使用安全等优点，具有极大的商业应用价值。利用植物毛状根技术进行hEGF表达，仅见在烟草毛状根中有报道，但烟草含有多种有害的生物碱，不利于hEGF的提纯或对烟草毛状根的综合开发利用。本发明基于寻求更安全植物表达宿主，将毛状根株系整株开发的理念，以植物毛状根表达系统为基础，选取农业生产上已经证明安全的植物材料花生(其植株是优良的牧草)为研究对象，将hEGF转化花生毛状根，探究hEGF在花生毛状根中的表达情况及毛状根的可持续培养能力，为综合利用花生毛状根合成hEGF提供技术支持，针对以上所述，那么如何发明出一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，这成为我们需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，解决了背景技术中所提出的问题。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，具体包括以下步骤方法,S1、R1601-hEGF菌株构建；S2、转hEGF花生毛状根的诱导与筛选；S3、转hEGF花生毛状根的摇瓶培养；S4、花生毛状根中hEGF的含量测定与蛋白特征分析。

作为本发明的进一步优选方式，将pCAMBIA1300Ⅰ质粒用BamHI、SacI双酶切，回收pCAMBIA1300Ⅰ质粒大片段，将hEGF与pCAMBIA1300Ⅰ大片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证，挑取转化成功的大肠杆菌DH5α菌落接种于LB液体培养基中37℃培养后，提取质粒DNA，即为构建的hEGF表达载体(命名为pCAMBIA1300I-hEGF)，于-20℃保存备用。将pCAMBIA1300I-hEGF转化发根农杆菌R1601感受态细胞，利用pCAMBIA1300I-hEGF表达载体的潮霉素抗性和发根农杆菌R1601的卡那霉素抗性，通过潮霉素和卡那霉素的双重抗性筛选，得到含有pCAMBIA1300I-hEGF的侵染菌株，28℃培养2-3天后，挑取单菌落进行菌落PCR验证，对转化成功的发根农杆菌R1601(命名为R1601-hEGF)。