[发明专利]粪便DNA提取试剂盒

说明书

本发明涉及医疗检测领域，尤其涉及一种粪便DNA提取保存液及保存管、试剂盒和提取方法。一种粪便DNA提取保存液，该保存液包括0.20~0.30M EDTA，0.2~0.8%丙氨酸，20~30%乙醇，0.2~0.8%十二烷基硫酸钠，1.0~5.0%聚乙烯吡咯烷酮，pH 10.0~11.0；上述的百分比为质量百分比。该保存液在高EDTA/碱性的条件下，采用酒精作为杀菌剂，同时采用丙氨酸作为高碱性环境的缓冲体系，并采用十二烷基硫酸钠和聚乙烯吡咯烷酮协同作为洗涤剂和去垢剂，能延长粪便保存时间，粪便离体后立即得到保护，确保了基因的完整性。

技术领域

本发明涉及医疗检测领域，尤其涉及一种粪便DNA提取保存液及保存管、试剂盒和提取方法。

背景技术

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，发生率仅次于胃癌和食道癌。近二十年来结直肠癌的发病率在逐渐增加，同时，其发病年龄趋向老龄化。在西方发达国家，结直肠癌是仅次于肺癌的第二位恶性肿瘤。近年来的一些研究表明K-ras，P53，APC，MMR等一些基因的突变会导致正常结肠黏膜上皮细胞转化成肿瘤细胞(Vogelstein，B.and Kinzler，K.W.，1993)，对这些基因突变的研究进展，使得通过粪便DNA检测诊断结直肠癌成为一种可能。而能否高效提取粪便中人基因组DNA成为影响诊断准确性的关键因素。

粪便成分复杂，含有大量多糖、胆酸等对人基因组DNA检测可产生抑制作用的成分，且粪便DNA绝大部分来源于肠道细菌，人源DNA含量很少。所以采集来的粪便样品需尽快保存，目前常用的保存方法一般是低温处理，即冷冻保存。冷冻方法操作复杂，成本高，无法快速便捷采集样本。

另外，试剂盒法是目前临床应用广泛且最简便的方法，商品化的粪便DNA提取试剂盒种类繁多，性能迥异，但粪便人基因组DNA提取效率不同。另外，由于临床粪便样本量大，采集后通常无法及时进行DNA提取即被储存，粪便中含有的大量核酸酶会对粪便DNA造成严重降解，因此，储存时间对人基因组DNA提取效率的影响很大。

如中国发明专利(公开号CN106967712A，公开日：2017.07.21)粪便DNA快速提取试剂盒，该提取试剂原理为：对所提取的粪便用粪便处理液进行前处理，离心除去粪便残渣和吸附去掉部分蛋白等杂质，用磁珠裂解液和蛋白酶K将核酸裂解释放出来，释放出来的核酸特异性的结合到混合了特异性探针的磁珠上，通过1轮洗涤液1和2轮洗涤液2的洗涤后，用洗脱液将核酸从磁珠上洗脱下来并把洗脱后的磁珠弃掉，最后得到粪便基因组。该专利还是重在于如何快速提取，对于如何有效的保存DNA，则不再考虑范围。

也有关于粪便DNA保存的技术，如中国发明专利(CN108866045A，公开日2018.11.23)公开了一种人类粪便DNA提取方法，该方法在人排出粪便后，立即采集2-5g粪便样品放入采集管中，采集管中装有10-15mL粪便保存，所述粪便保持液成分：0.3-0.6MEDTA，3-6M NaCl，0.3-1.5M Tris。中国发明专利(公开号CN107980763A公开日2018.05.04)公开了粪便保存试剂，包括细胞缓冲液、细胞固定剂、金属离子螯合剂和防腐剂；细胞缓冲液为Tris-HCl，工作pH范围为8-10；细胞固定剂选自SDS、Triton X-100和PEG-2000中的至少一种；金属离子螯合剂为EDTA和/或EDTA-Na2；防腐剂为NaCl。这两个技术都是采用Tris-HCl缓冲体系，NaCl作为防腐剂，在实际应用中DNA还是容易降解，对人基因组DNA提取效率的影响很大。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种粪便DNA提取保存液，该保存液在高EDTA/碱性的条件下，采用酒精作为杀菌剂，同时采用丙氨酸作为高碱性环境的缓冲体系，并采用十二烷基硫酸钠和聚乙烯吡咯烷酮协同作为洗涤剂和去垢剂，能延长粪便保存时间，粪便离体后立即得到保护，确保了基因的完整性。