[发明专利]一种通过微生物发酵制备曲地酸的方法

权利要求书

1.一种制备曲地酸的方法，包括如下步骤：

发酵培养Pseudogymnoascus pannorum BJZ13；Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的保藏登记号为CGMCC No.15389；发酵培养包括如下步骤：

（1）将Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的单菌落接种至种子培养基，15 ℃、120r/min振荡培养7天，得到种子液；种子培养基的制备方法：可溶性淀粉20 g/L、FeCl₃ 0.00065g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、KH₂PO₄ 0.5 g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.65 g/L，余量为水，调pH至7.2-7.4，然后121 ℃高压灭菌20 min，冷却至室温时添加氨苄抗生素并使其浓度为1μL/mL；

（2）将步骤（1）得到的种子液接种至装有发酵培养基的锥形瓶，15℃静置培养40天，得到发酵培养的产物；发酵培养基的制备方法：取500 mL锥形瓶，加入50 g大米和80 mL 蒸馏水，121℃高压灭菌20 min；

取发酵培养的产物，采用乙酸乙酯进行提取，然后收集乙酸乙酯相进行减压浓缩，得到浸膏；然后取浸膏，采用二氯甲烷进行提取，然后收集二氯甲烷相进行减压浓缩，得到二氯甲烷相浸膏；

取二氯甲烷相浸膏，用二氯甲烷溶解，然后进行正相硅胶开放柱色谱分离；

取正相硅胶开放柱色谱分离收集的液体，减压浓缩，然后进行结晶，结晶析出后析出多余液体，再加入二氯甲烷/甲醇混合体系使结晶完全溶解，然后进行重结晶，待结晶析出后析出多余液体，再加入二氯甲烷/甲醇混合体系使结晶完全溶解，然后进行重结晶，得到的针状结晶，即为曲地酸；二氯甲烷/甲醇混合体系由10体积份二氯甲烷和1体积份甲醇混匀得到。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机相提取的方法包括如下步骤：

（1）取发酵培养的产物，加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；

（2）完成步骤（1）后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；

（3）完成步骤（2）后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；

（4）完成步骤（3）后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；

（5）将步骤（2）得到的乙酸乙酯相、步骤（3）得到的乙酸乙酯相和步骤（4）得到的乙酸乙酯相合并，减压浓缩，得到浸膏；

（6）取步骤（5）得到的浸膏，用二氯甲烷进行提取，然后减压浓缩，得到二氯甲烷相浸膏。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

正相硅胶开放柱色谱分离的参数：硅胶粒度为100-200目；洗脱初始时刻流动相为二氯甲烷，洗脱终止时刻流动相为甲醇，洗脱过程中的流动相为二氯甲烷和甲醇的混合物；流动相的流速为3 mL/min；洗脱过程为50 h，洗脱过程中，二氯甲烷占流动相的体积份数由100%线性下降至0%，相应的甲醇占流动相的体积份数由0%线性上升至100%；收集二氯甲烷占流动相的体积份数为98%-94%时的组分。