[发明专利]搭载抗PD-1单链抗体的基因工程化红细胞及其制备方法

说明书

本发明属于医药生物领域，具体涉及搭载抗PD‑1单链抗体的基因工程化红细胞的制备方法，包括如下步骤：将目的片段序列构建于慢病毒表达载体；将目的序列载体进行慢病毒包装，获得高滴度的慢病浓缩液；从外周血单个核细胞中分离和富集Lin‑CD34‑细胞；诱导所述Lin‑CD34‑细胞向红系分化并进行扩增；使用慢病毒浓缩液对Lin‑CD34‑细胞进行感染；通过红细胞脱核得到成熟的anti‑PD‑1scFv‑红细胞。本发明还提供了搭载抗PD‑1单链抗体的基因工程化红细胞，将抗PD‑1单链抗体靶向递送至肿瘤组织使其更有效的发挥T细胞激活功能，并能明显减少药物用量，缓解全身性的肿瘤免疫药物带来的副作用。

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及搭载抗PD-1单链抗体的基因工程化红细胞及其制备方法。

背景技术

免疫疗法已成为治疗癌症非常有力的手段之一。用于免疫治疗的药物获批越来越多，处于临床和临床前开发的项目也越来越多。然而，免疫疗法是一种广泛的针对全身免系统的治疗策略，所以关键仍然是免疫系统受到的调控，目前的免疫疗法的主要存在的问题是诸如自身免疫和非特异性炎症等副作用。而如何通过提高免疫疗法的反应率来提高治疗效果以及控制不良反应成为了关键所在。如何更有效的将用于免疫治疗的药物（例如：抗PD-1、CTLA-4单克隆抗体、IL-2、TNF-α等）进行体内递送并且减少毒副作用是有待探索和急待解决的。

红细胞的许多独特特征使其成为体内递送天然和合成成分非常有吸引力的研究目标。1）循环范围广，且数量多，可以用于药物携带；2）通过网状内皮系统可以除去衰老或受损的红细胞，可以实现完全的生物降解，不会产生有毒物质；3)具有良好的生物相容性，特别是在使用自体红细胞时；4）与其他合成载体相比具有较长的循环半衰期（人类约120天）；5）没有细胞核，没有线粒体和任何DNA，对红细胞的前体进行任何形式的基因工程修饰，在其去核后都会被消除，故该细胞在输入受体后不会导致异常生长或成瘤。6）它们保护包封的物质免于过早失活和降解，并保护生物体免受药物的毒性作用，同时也可以成为蛋白类药物的生物反应器。

程序性细胞死亡蛋白1，也称为PD-1和 CD279，是细胞表面的一种蛋白质，通过与其配体PD-L1结合向下调节免疫系统对人体细胞的反应。通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受。这可以预防自身免疫性疾病，但它也可以防止免疫系统杀死癌细胞。PD-1是一种免疫检查点，通过两种机制防止自身免疫。首先，它促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡（程序性细胞死亡）。其次，它减少了调节性T细胞（抗炎，抑制性T细胞）的细胞凋亡。在肿瘤疾病状态中，肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1 的相互作用降低了T细胞功能信号，从而阻止免疫系统攻击肿瘤细胞。阻断PD-L1与PD-1受体相互作用的抑制剂（单克隆抗体）的使用可以防止癌症以这种方式逃避免疫系统，从而实现肿瘤治疗。通过使用抗PD-1单克隆抗体可以在临床上针对包括黑色素瘤、头颈部癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌等癌症中取得了明显的治疗效果。然而在这些适应症中，只有约20~30%的晚期癌症患者对抗PD-1单克隆抗体治疗有响应，大多数患者对抗PD-1疗法并不敏感，主要原因是药物不能靶向递送至肿瘤组织，药物自身免疫原性，利用率低等，同时造成较高的全身性的肿瘤免疫药物副作用。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了搭载抗PD-1单链抗体的基因工程化红细胞，目的在于解决抗PD-1单克隆抗体递送不能靶向至肿瘤组织，利用效率低下，以及造成较高的全身性的肿瘤免疫药物副作用的技术问题。本发明还提供了搭载抗PD-1单链抗体的基因工程化红细胞的制备方法。

具体技术方案如下：

搭载抗PD-1单链抗体的基因工程化红细胞的制备方法，包括如下步骤：