[发明专利]利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的试剂盒

权利要求书

1.一种利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的试剂盒，其特征在于，包括：

1)带ccdB基因表达盒子的环状载体：由ccdB基因表达盒子和表达载体构成；

2)载体扩增引物HF和HR；

所述载体扩增引物用于扩增表达载体；

所述ccdB基因表达盒子是含有启动子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；所述表达载体不含抗生素A的抗性基因，而含有抗生素B的抗性基因。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，它还包括：

耐受ccdB蛋白的感受态细胞。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述耐受ccdB蛋白的感受态细胞是大肠杆菌DB3.1的感受态细胞。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗生素A是氯霉素。

5.如权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于，所述ccdB基因表达盒子的序列如SEQID NO：14所示。

6.权利要求1～5任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计目的基因扩增引物gene-HF与gene-HR，其序列均包括2个片段：(I)用于扩增目的基因的片段，(II)用于与表达载体同源重组的片段；片段(I)位于片段(II)的3’侧；所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的部分或全部片段；

(2)使用HF和HR扩增带ccdB基因表达盒子的环状载体，使用gene-HF和gene-HR扩增目的基因片段；

(3)将步骤(2)中的扩增产物混合，转化入对ccdB敏感的感受态细胞，于含有抗生素B的培养基中培养；

(4)挑取单克隆，扩大培养，提取质粒，纯化，即得。

7.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的全部片段。

8.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)所述同源重组的序列长度为18nt。

9.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(3)中混合的扩增产物中，目的基因的扩增产物的物质的量为环状载体扩增产物的2倍。

10.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(3)所述的感受态细胞为大肠杆菌DH5α。