[发明专利]利用多重PCR富集目标DNA片段的方法

说明书

本发明公开了利用多重PCR富集目标DNA片段的方法。本发明公开的富集目标DNA片段的方法包括利用满足如下条件的成套引物进行多重PCR富集目标DNA片段：每个引物对的因素J＜50％且9个因素中至多一个因素不在标准范围内；9个因素标准范围：35％≤因素A≤60％；68℃≤因素B≤79℃；30％≤因素C≤70％；30％≤因素D≤70％；15kcal/mol≤因素E的绝对值≤70kcal/mol；因素F的绝对值＜100kcal/mol；因素G的绝对值＜100kcal/mol；4kcal/mol≤因素H的绝对值≤10kcal/mol；因素I＜100℃。利用本发明的方法可以成功富集基因组中目标DNA片段。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，利用多重PCR富集目标DNA片段的方法。

背景技术

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(NextGeneration Sequencing,NGS)是2004年后新兴的一系列测序技术，能一次平行对大量(几十万到几百万)DNA分子进行序列测定。已经在基因组从头测序、基因组重测序、转录组测序、表观遗传学、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)开发等等方面，将使基因组学成为研究生物学问题的常规方法，成为人们研究分子生物学、分子遗传学等等的有力工具。

在多种新一代测序技术中，Illumina公司开发的基因组分析仪(GenomeAnalyzer,GA)是由隶属英国剑桥大学的Solexa公司建立，是基于边合成边测序(Sequencing by Synthesis)原理，由于具有成本相对较低、通量大、前处理较为简单等等优势，是目前使用最广泛的二代测序技术平台。Illumina不断升级GA，特别是HiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq系列测序仪研发完成。

Illumina GA和HiSeq测序平台都需要严格的样品前处理过程，并且不具有选择性，因此，如果对基因组(或转录组)中某一特定的区域感兴趣，则需要在Illumina样品前处理之前对目标区域进行选择性的富集。目前通用的选择性富集的方法包括PCR、MIP(Molecular Inversion Probe)和DNA芯片(Microarray)。其中，MIP和DNA芯片技术较为复杂，适合大量群体中目标片段的富集，成本费用高，需要的起始基因组DNA的用量大。并且这些方法都需要建立质量较高的样品文库，从而增加了实验的成本费用。PCR技术是一种具有良好的选择性并且技术要求较低的方法，虽然扩增中会产生核苷酸的突变会在Illumina的样品前处理中放大，造成过多的假阳性结果；但是随着二代测序技术的不断发展(例如Illumina GA在2006-2012年间更新了6代，Illumina Hiseq在2010-2015年之间更新了7代)，测序的成本费用在不断的降低，测序长度在不断的增加，那么增加测序深度足以能解决由于PCR选择性富集的缺陷。

PCR(聚合酶链式反应)是在基因组上设计特异性的引物序列对目标片段进行特异性的扩增。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quatitative PCR,FQ-PCR)技术、单分子PCR技术和微滴PCR技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何富集基因组中的目标DNA片段。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了利用多重PCR富集目标DNA片段的方法，所述目标DNA片段为n个，n为大于等于2的自然数，所述方法包括：利用多重PCR方法扩增得到目标DNA片段，实现目标DNA片段的富集；

所述多重PCR方法，包括：利用成套引物对目标DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物记为PCR产物1；所述成套引物满足如下a1)、a2)和a3)：