[发明专利]一种用于未知RNA真菌病毒基因组克隆的引物和方法

权利要求书

1.一种对未知RNA真菌病毒基因组克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)真菌病毒dsRNA的提取；

(2)利用连接酶将正向引物与dsRNA进行连接，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，得到连接产物并将所述连接产物进行纯化；

(3)以所述连接产物为模板，利用互补引物和随机引物进行反转录合成cDNA第一链，所述互补引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

(4)以所述cDNA第一链为模板，以所述互补引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(5)对所述PCR扩增产物进行克隆测序；

所述步骤(2)中的连接体系具体如下：在20uL连接体系中加入200ng的dsRNA，含10mMATP的10×T4 RNA Ligase Buffer 2uL，质量百分数为50％的PEG 10uL，T4 RNALigase 0.5uL，T4 DNA Ligase 0.5uL，质量百分数为0.1％的BSA 1uL，浓度为20uM的正向引物1uL，最后用ddH₂O补足至20uL；

反应条件为：37℃连接3h，16℃连接16h，在连接产物中加入dNTP 0.5uL，Taq DNApolymerse 0.5uL和10×PCR Buffer 3uL，ddH₂O补足至30uL，70℃反应20min；

所述步骤(3)中cDNA第一链合成的反应体系如下：连接产物4ul，互补引物2uL与DMSO2uL加入DEPC处理过的2uL离心管中，于99℃水浴3min，迅速置于液氮中lmin，后移置冰上；再依次加入，5×RT Buffer 4uL，dNTP 2uL，DTT 2uL，RNaseInhibitor 1uL，SuperScriptTMIIRNase H-Reverse Transcriptase1uL，42℃反应1h；

所述步骤(4)中PCR反应体系包括：ddH₂O 34.5uL，10×PCR Buffer 5uL，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 6uL，浓度为20mM的互补引物1uL，cDNA 10ul，LA TaqTM 0.5uL；扩增条件为：94℃1min后，94℃10sec，56℃10sec，72℃2min，共35循环，然后72℃延伸5min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法用于获得未知病毒dsRNA全长cDNA序列。