[发明专利]乌鸫系统发育树的构建方法

说明书

本发明公开了一种乌鸫系统发育树的构建方法，属于分子生物学技术领域，包括以下步骤：(1)采集乌鸫标本；(2)乌鸫mtDNA基因组的提取；(3)引物设计和PCR基因扩增；(4)测序、拼接及序列分析；(5)构建系统发育树，确定乌鸫及近缘物种系统分类地位；本发明分析乌鸫线粒体基因组序列特征以及重建了乌鸫与近缘物种系统发育树，一方面可以让乌鸫的分子信息库更加完整，有利于对该属物种以及近缘物种的进一步保护和利用，而且本发明也为其它鸟类的研究提供了研究基础和分子数据。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种乌鸫系统发育树的构建方法。

背景技术

乌鸫(学名：Turdusmerula)，属于鸟纲(Aves)、雀形目(Passeriformes)、鸫科(Turdidae)、鸫属(Turdus)，其分布广泛，种群数量较多，在欧亚大陆、北非、印度次大陆、印度支那、斯里兰卡、马尔代夫，及中国的西南地区等地均为常见，分布高可至海拔4000m以上的山区。乌鸫是雌鸟孵卵，具有补卵行为和坐巢行为，为农林益鸟，某些地方利用乌鸫取食蝗虫、草地螟、地老虎等害虫的特点来达到生物防治害虫的目的。这种生物防治手段不仅有效控制了虫害，而且与公共植保、绿色植保、低碳植保方针相一致；所以，各种、亚种乌鸫的保护和利用越来越重要。但是，目前对于乌鸫的生物学信息和所处的系统进化地位了解很少，限制了对于各种、亚种乌鸫的进一步保护和利用。

发明内容

本发明的目的就在于提供乌鸫系统发育树的构建方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：

一种乌鸫系统发育树的构建方法，包括以下步骤：

(1)采集乌鸫标本；

(2)乌鸫总基因组的提取

从步骤(1)采集的乌鸫标本中提取乌鸫总DNA；

(3)引物设计和PCR基因扩增

设计可覆盖乌鸫mtDNA全序列的引物，然后采用所述引物对步骤(2) 所得的总DNA，进行PCR扩增，扩增所得目的片段之间的重叠为100-200bp，得到基因样本；

(4)测序、拼接及分析

将步骤(3)所得的基因样本进行测序，然后利用测得的数据分析其线粒体全基因组的成分、基因的排列顺序和碱基组成特征；再进行序列拼接，得到乌鸫线粒体基因组全序列，如SEQ ID NO:1所示；根据拼接得到的基因组全序列确定乌鸫的13个蛋白质编码基因；预测各tRNA的二级结构，并根据预测结果绘制；最后对线粒体全基因组、13个蛋白质编码基因、22个tRNA、2个rRNA 和D-loop进行特征分析；

(5)构建系统发育树

根据已知的鸟类的13个蛋白质编码基因，用白颊噪鹛和火尾希鹛13个蛋白质编码基因作为外群，去终止密码子后拼接，构建得到系统发育树。

作为优选的技术方案：步骤(2)中，提取方法为SDS-酚-氯仿-异戊醇抽提法。

作为优选的技术方案：步骤(3)中，设计引物的方法为：根据NCBI上现已提交的6个乌鸫近缘物种的mtDNA全基因组序列，使用Primer5.0设计。

作为优选的技术方案：步骤(3)中，设计的引物对为12对，其具有如T1-T12 所示的序列。

作为优选的技术方案：步骤(4)中，所述序列拼接的方法为DNA Baser Assembler和人工排查。

作为优选的技术方案：步骤(4)中，所述确定乌鸫的13个蛋白质编码基因的方法为：利用BLAST进行同源性搜索，通过对比NCBI上前人所提交的鸫属其它鸟类的线粒体全基因组。