[发明专利]一种马缨杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法

说明书

本发明提供一种适用于马缨杜鹃遗传转化和再生体系建立的方法，属于生物技术领域，其遗传转化方法包括：种子预处理后暗培养2‑6d；超声波处理20‑40min；将农杆菌转化，活化；农杆菌侵染20‑60min后共培养；脱菌；萌发培养、筛选培养、生根培养。其再生体系建立的方法包含：无菌苗培养；在添加卵磷脂的培养基中诱导愈伤组织并进行愈伤组织增殖培养；分化培养、壮苗培养、生根培养。本发明一种马缨杜鹃遗传转化的方法高效、稳定、简便、快速，利用分子调控机制建立的马缨杜鹃的再生体系更加高效，精确。

技术领域

本发明属于生物技术领域，进一步，涉及一种适用于马缨杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法。

背景技术

杜鹃花属(Rhododendron L.)，灌木或乔木，有时矮小成垫状，地坐或附生；植株无毛或被各式毛被或被鳞片。叶常绿或落叶、半落叶，互生，全缘，稀有不明显的小齿。花芽被多数形态大小有变异的芽鳞。杜鹃属中不同种类，具有较为广泛的观赏价值、园艺价值和药用价值。中国花卉协会杜鹃花分会统计显示，截至2008年底，我国国内有17个城市以杜鹃花为市花，杜鹃花的年宵花、盆栽杜鹃以及绿化杜鹃已经形成为较大的产业，杜鹃花生产面积已经超过2500公顷。然而，尽管我国野生杜鹃种类繁多，但应用于生产的杜鹃新品种，大多来自于国外，我国的杜鹃花新品种选育工作迫在眉睫。

植物基因工程自20世纪80年代诞生以来，转化技术和转化用的基因功能研究工作均取得了巨大进展。目前广泛应用的植物转基因方法包括基因枪法、农杆菌介导法、电击法等，均已取得成功。然而，这些方法均存在重复性差、转化周期冗长、整合频率低等缺点。为了克服这些难题，科学家们进行了不懈努力，研发了新的技术和方法，包括花粉管通道法、真空渗透法、胚型组织浸染法及农杆菌介导植物萌发种子法等，这些方法均不依赖于植物细胞组织培养的转化系统，具有操作简单、转化周期短等优点，使得转化研究更加便捷。

本发明采用农杆菌介导植物萌发种子法实现马缨杜鹃的遗传转化，在避免组织培养的基础上，加快了种子的萌发、提高了农杆菌的侵染效率、促进农杆菌T-DNA高效转移到植物细胞、促进农杆菌T-DNA整合到植物染色体并高效选择转化细胞，建立了一种高效、稳定、简便、快速的马缨杜鹃转基因途径。此外，本发明公开了一种适用于马缨杜鹃的再生条件，通过分子调控机制提高愈伤组织的诱导率和增殖率，效果更好更精确，建立了马缨杜鹃高效的再生体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、稳定、简便、快速的马缨杜鹃遗传转化的方法。本发明还有一个目的在于提供一种利用分子机制建立的马缨杜鹃的高效再生体系的方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

本发明公开一种适用于马缨杜鹃的遗传转化的方法，包括以下步骤：

种子预处理后黑暗预培养2-6天；

超声波处理；

农杆菌转化，重组体为pCAMBIA3301重组质粒，含有卡那霉素抗性基因nptⅡ、报告基因GusA和外源目的基因Bar；

农杆菌活化培养、侵染与共培养；

脱菌清洗；

萌发培养、筛选培养、生根培养。本发明采用农杆菌介导植物萌动种子的方法对马缨杜鹃进行遗传转化，取材不受时间和环境限制，容易获得，用农杆菌感染的萌动种子直接生根发芽成完整植株的方法，不用进行组织培养，时间花费少，遗传转化稳定，加快了获得转基因马缨杜鹃的进程。杜鹃种子在用农杆菌侵染前，在含有外源激素的培养基上经过一段时间的预培养，可以刺激细胞进行脱分化使细胞分裂，而处于分裂状态的细胞更易于感受和整合外源基因，从而提高转化频率。