[发明专利]一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记

权利要求书

1.一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，该SCAR标记为SC343-1.4K-12，其在Genbank的序列号为MK584624。

2.根据权利要求1所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，其制备步骤包括：

S1、实验材料的采集和鉴定；采集罗汉果雌雄单株各30株，其性别均在开花后根据花器官的结构予以确定；

S2、罗汉果DNA的提取；称取罗汉果幼叶0.1g，在液氮中磨碎后提取其总DNA，接着采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和完整性，最后进行DNA的定量检测。

S3、构建DNA雌雄池；将DNA稀释至统一浓度，-20℃保存备用；随机选择雌雄单株各10份，取等量DNA混匀构建DNA雌雄池；

S4、RAPD引物筛选；首先用雌雄池对所有的RAPD引物进行第一轮初筛，选择条带有差异的引物；接着利用雌雄单株各10份对其进行第二轮筛选，从中选择对应关系较好的引物；再对所有的雌雄单株进行第三轮筛选验证，最终得到一条雄性特异带；

S5、特异性片段的回收、克隆和测定；从琼脂糖凝胶中挑取该雄性特异条带，利用DNA纯化回收试剂盒进行目的片段的回收和纯化；将目的片段克隆至T载体上并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；通过蓝白斑筛选挑取白斑菌落，应用菌落PCR确定阳性克隆，摇菌后用质粒小提试剂盒提取质粒进行测序；

S6、SCAR引物的设计及特异性验证；根据DNA测序的结果，在RAPD引物的基础上，向内延伸12bp，设计出相应的SCAR引物SC343-1.4K-12；将引物序列合成；利用该SCAR引物对罗汉果雌雄单株进行特异性的验证。

3.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S1中，罗汉果雌雄株材料采集地为广西桂林市永福县和临桂区等地。

4.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S2中，采用改良CTAB法提取罗汉果的DNA。

5.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S3中，根据混合分离群体分析法原理，构建DNA雌雄池。

6.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S4中，根据上海生工生物工程有限公司随机引物目录，随机选择10bp的碱基RAPD引物进行RAPD引物筛选。

7.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S5中，经克隆测序后，雄性特异条带的实际长度为1373bp。