[发明专利]一种基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)基于无脊椎动物重组铁蛋白的制备

A.铁蛋白基因序列的克隆

a.基因扩增

以Fer147基因序列作为模板，该基因序列为SEQ ID NO.1所示的cDNA序列，设计上游扩增引物FER-F：5′-

CCGCTCGAGAATTAGGAGGAAGTCCAAGA-3′；和下游扩增引物FER-R：5′-CGCCATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3′，PCR扩增Fer147目的基因，利用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收和纯化，得到Fer147目的基因；

b.原核表达载体的构建

利用Nde I和Xho I两种限制性内切酶分别对Fer147目的基因和pET-28a(+)表达载体进行酶切，然后利用胶回收试剂盒分别对酶切产物进行回收纯化；利用DNA连接酶将酶切后的Fer147目的基因片段与pET-28a(+)空载质粒进行连接后，转化到感受态细胞DH5α中，经平板筛选PCR扩增及测序比对后，得到含有目的基因的阳性克隆子菌落，扩大培养后，利用质粒提取试剂盒提取质粒，得到含有Fer147的重组表达载体；所得重组表达载体转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，经平板筛选PCR扩增，得到含有目的基因的大肠杆菌BL21表达菌株；

c.原核表达

将含有目的基因的大肠杆菌BL21表达菌株按体积比1:50的比例分别接种于10mL含有30μg/mL卡那霉素LB培养基，37℃，120rpm培养至OD₆₀₀＝0.6，添加终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)于培养基中，摇床转速为125rpm，分别在温度为20℃条件下诱导18h和温度为37℃诱导5h；所得菌液于6500rpm离心15min收集菌体，弃上清培养基，菌体用2mL破碎缓冲液悬浮，经超声破碎后的溶液于12000rpm冷冻离心机离心10min，收集上清；取40μL上清液加入10μL 5×蛋白上样缓冲液，充分混匀，放入100℃的金属浴中加热处理10min，再低速离心30s，收集蛋白上清液即为含有目的基因蛋白Fer147的上样液；

B.蛋白纯化

将装有填料的镍柱连接在蛋白纯化系统上，用蛋白缓冲液对镍柱进行冲洗；将离心好的蛋白上清溶液流经镍柱后，用蛋白洗涤缓冲液Ⅰ对镍柱中的杂蛋白进行冲洗，直至蛋白纯化仪检测到的信号下降到平稳状态；随后用蛋白洗涤缓冲液Ⅱ对目的蛋白进行洗脱，当蛋白纯化仪检测到信号有上升趋势时，洗脱下来的溶液为需要收集的蛋白溶液，收集洗脱液，直到信号下降到基线平稳状态；将收集的含有目的蛋白的洗脱液置于30kD的超滤管浓缩，转速控制在3000-3500rpm，离心过程中用蛋白缓冲液进行多次交换，以去除残留的高浓度咪唑，最后将蛋白溶液浓缩到呈浅橙黄色为止；在浓缩的蛋白中加入适量的SUMO酶，至于4℃环境中酶切过夜，酶切后的混合溶液通过镍柱再次纯化，取流穿液，即酶切后不带标签的目的蛋白，即基于无脊椎动物重组铁蛋白；

(2)重金属的富集

将基于无脊椎动物重组铁蛋白置于透析袋中，在5mM亚砷酸钠溶液中进行透析，整个富集过程中使用磁力搅拌器模拟流动液体，透析12h后，将透析袋置于蛋白缓冲液中透析12h，期间每隔4h更换一次蛋白缓冲液，以除去未被重组蛋白吸附的重金属离子，取出透析袋中的蛋白溶液经浓缩后，得到基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球，其中所述的破碎缓冲液的配方为25mM Tris，150mM NaCL，pH 8.0，0.5％triton X-100；所述的蛋白缓冲液的配方为25mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0；所述的蛋白洗涤缓冲液Ⅰ的配方为25mM Tris，150mM NaCl，50/70/100mM咪唑，pH 8.0；所述的蛋白洗涤缓冲液Ⅱ的配方为25mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0。

2.一种权利要求1制备的基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球在制备慢性粒细胞白血细胞K562抑制剂方面的应用。