[发明专利]一种表达人促卵泡生长激素（FSH）的方法

说明书

本发明公开了一种表达人促卵泡生长激素(FSH)的方法。本发明将人促卵泡生长激素目的基因克隆到腺病毒载体，包装得到的重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞可以高效表达得到具备体外生物活性的重组人促卵泡生长激素蛋白。本发明提供了一种利用重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞制备重组人促卵泡生长激素的方法，该方法利用动物泌乳功能的乳腺上皮细胞制备了可分泌到细胞外且具备体外生物活性的重组人促卵泡生长激素蛋白，为动物乳腺上皮细胞用于制备重组人促卵泡生长激素蛋白可提供了可靠的方法，对将来利用转基因羊、牛等大动物乳腺生产重组人促卵泡搜生长激素提供可靠的技术依据。

技术领域

本发明涉及生物医药与基因工程技术领域，特别是涉及一种表达人促卵泡生长激素(FSH)的方法。

背景技术

人促卵泡生长激素(FSH)是由下丘脑控制的垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的糖蛋白类促性腺激素，它是一种由FSHα亚基与FSHβ亚基通过非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白。其中FSHα亚基基因编码了92个氨基酸，包含10个半胱氨酸，形成5个二硫键；FSHβ亚基基因编码了111个氨基酸，其中包含12个半胱氨酸，形成6个二硫键。人促卵泡生长激素在女性体内的主要功能是促进子宫内膜的生长、卵泡的发育和排卵等，临床上主要用于辅助生殖方面超数排卵等功能。

目前市场对于人促卵泡生长激素产品的需求巨大，市面上主要有两种人促卵泡生长激素产品，一种是尿源的人促卵泡生长激素，另外一种是国外进口的基因工程重组人促卵泡生长激素(rhFSH)蛋白，其中在国内市场的临床应用上进口重组人促卵泡生长激素占据主要市场。尿源FSH蛋白药物如瑞士Serono公司的Tertinex/metrodin，以及我国丽珠集团的丽申宝。进口的重组促卵泡生长激素目前主要是利用基因工程技术和细胞培养工艺来制备重组促卵泡激素生物制品，如瑞士Serono公司的Gonal-F以及荷兰Organon公司的Puregon等进口的重组hFSH都是这类产品。

重组人促卵泡生长激素相比尿源提取人促卵泡生长激素有纯度高、生物活性高、来源均一的特点，并且它不含有促黄体激素及其他杂蛋白的污染，但是国外进口的重组人促卵泡生长激素主要是细胞表达的基因工程产品，受制于细胞表达量低的因素，生产成本较高，因此进口重组人促卵泡生长激素价格较为昂贵。

要突破国外进口重组人促卵泡生长激素药物的价格壁垒，开发出国内生产的重组人促卵泡生长激素，需要充分利用现逐渐成熟的技术来实现。目前利用动物乳腺制备重组蛋白药物是重组蛋白药物制备热门的研究领域之一，动物乳腺制备重组蛋白药物具备产量高、价格低的优势。但是目前还未见大动物乳腺制备重组人促卵泡生长激素相关研究报导，主要原因还是制备转基因大动物来制备重组人促卵泡生长激素药物是需要复杂的技术程序操作，在大动物上获得转基因动物的成功率较低，成本很高，因此在制备转基因大动物用于乳腺表达重组重组人促卵泡生长激素蛋白国内外未见相关报道。

发明内容

为了克服目前重组人促卵泡生长激素的生产上的技术体系缺陷，本发明旨在提供一种利用腺病毒载体在动物乳腺上皮细胞表达人促卵泡生长素的方法，通过体外动物泌乳功能细胞生产重组人促卵泡生长激素。本发明的优势在于选用腺病毒进行人促卵泡生长素基因动物乳腺上皮细胞的表达，可以高效表达目的蛋白重组人促卵泡生长激素，由于腺病毒载体不会整合到宿主细胞的染色体基因中，因此避免了宿主细胞基因突变等危险因素，更加安全可靠，同时利用体外动物乳腺上皮细胞进行人促卵泡生长素基因的表达，在细胞层面为动物乳腺制备其他重组蛋白提供前期的技术依据，探索了动物乳腺细胞制备重组人促卵泡生长激素蛋白药物的可能性与有效性。

本发明方案由如下步骤组成：

(1)重组人促卵泡生长激素腺病毒载体的构建