[发明专利]一种组成型剪接报告基因影像探针及其制备方法

说明书

本发明公开了一种组成型剪接报告基因影像探针及其制备方法，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A‑B‑C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A由Exon1和Intron1组成，所述的片段B为Rluc，所述的片段C由Exon2和Intron2组成。所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明的报告基因分子影像探针可以模拟活体pre‑mRNA加工为成熟mRNA的过程，为模拟活体pre‑mRNA加工过程的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具，同时为作用于剪接体的药物研究提供了有效的筛选工具。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种组成型剪接报告基因影像探针及其制备方法。

背景技术

DNA转录生成前体mRNA(pre-mRNA)，当其翻译成蛋白质时需要移除pre-mRNA中的内含子，使外显子的编码序列拼接在一起形成成熟mRNA，此过程即为RNA剪接，通过5个小核核糖核蛋白颗粒(snRNP；U1，U2，U4，U5和U6snRNP)和超过200种蛋白质组成的RNA和蛋白质巨型复合物完成剪接。RNA的加工是基因表达的重要环节。真核生物中，Pre-mRNA剪接是DNA到蛋白质信息流动的重要环节。pre-mRNA的剪接与许多疾病的发生发展密切相关，尤其是恶性肿瘤，pre-mRNA剪的病理学改变能够促使癌症的发生和发展。在分子水平上利用pre-mRNA剪接的特异性来干扰基因的表达从而达到肿瘤疾病治疗的目的是一个切实可行的治疗策略。传统的检测pre-mRNA剪接的方法都是体外、破坏性的检测法，如测序法PCR、Northern杂交、微阵列芯片、放射性原位杂交等，这些方法自身有许多局限性，如样本处理过程复杂，均为侵入性的检测方法，不能在体实时动态监测pre-mRNA的成熟加工过程。

本发明运用分子影像手段，弥补了上述缺点，通过载体报告基因系统在活体中的稳定表达，无创、重复的提供活体、实时、动态、可视化的分子剪接信息，同时进行定量研究，获得的数据与常规研究手段所获得的数据比较，更加接近机体的真实情况。建立高通量的pre-mRNA在体剪接分析系统，可实时评估剪接体在体内的剪接过程及剪接效能，检测体内基因表达情况及疗效等。对剪接体相关治疗基因进行成像，对于优化基因治疗方案和评估疗效起着关键作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种组成型剪接RLuc-intron报告基因影像探针系统及其构建方法，并用于在体监测pre-mRNA剪接过程的发生发展。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种组成型剪接报告基因影像探针，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A由Exon 1和Intron 1组成，所述的片段B为Rluc，所述的片段C由Exon 2和Intron 2组成。

所述的片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述的片段C的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的另一方面，提供了上述组成型剪接报告基因影像探针的制备方法，包括以下步骤：

1)用NheI和PstI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；

2)PCR扩增A、B、C片段；

3)通过基因重组技术将各个片段按A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组；

4)重组载体经转化、提取质粒、酶切鉴定，获得Rluc-intron报告基因探针。

所述的片段A由Exon 1和Intron 1组成，所述的片段B为Rluc，所述的片段C由Exon2和Intron 2组成。