[发明专利]与硼砂特异性结合的核酸适配体及利用SELEX筛选方法和应用

权利要求书

1.一种与硼砂特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述与硼砂特异性结合的核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的与硼砂特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述与硼砂特异性结合的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能DG＝-11.90。

3.如权利要求1所述的与硼砂特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述与硼砂特异性结合的核酸适配体基于酶联寡核苷酸吸附测定法ELONA，进行其特异性、亲和力和灵敏度性质评估。

4.一种如权利要求1所述与硼砂特异性结合的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述与硼砂特异性结合的核酸适配体的筛选方法包括以下步骤：

第一步，硼砂特异性核酸适配体的筛选、克隆、分离和测序；

第二步，核酸适配体单链DNA二级结构表征；

第三步，硼砂包被原的制备；

第四步，核酸适配体的特异性、亲和力及对硼砂的灵敏性；

第五步，核酸适配体的截短实验分析。

5.如权利要求4所述的与硼砂特异性结合的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述第一步具体包括：采用SELEX技术筛选出能够与硼砂特异性结合的核酸适配体群体，设计引物进行PCR扩增、克隆、分离和测序；利用酶联寡核苷酸吸附实验进行验证，得到适配体Bor-B02；适配体的接头引物序列为：Aptamer Fw：GACATATTCAGTCTGACAGC；反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC；Aptamer Rv:GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC；所获阳性单克隆进行核苷酸序列测定，测序结果表明与硼砂特异性结合的核酸适配体由82个核苷酸组成，其序列(5’端至3’端)为：

GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC。

6.如权利要求4所述的与硼砂特异性结合的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述第二步具体包括：使用MFOLD软件对与硼砂特异性结合的核酸适配体Bor-B02单链DNA分子进行二级结构预测；二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能DG＝-11.90。

7.如权利要求4所述的与硼砂特异性结合的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述第三步具体包括：通过化学法将硼砂分子与BSA偶联从而获得硼砂的包被原，通过紫外吸收光谱判断包被原的制备情况，结果显示硼砂与BSA成功偶联；

所述第四步具体包括：根据核酸适配体Bor-B02的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立酶联寡核苷酸检测方法，对核酸适配体的特异性、亲和力及其对硼砂的灵敏性进行检测。

8.如权利要求4所述的与硼砂特异性结合的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述第五步具体包括：通过ELONA法对核酸适配体Bor-B02进行截短以确定最佳结合位点；基于核酸适配体Bor-B02预测的二级结构，对适配体Bor-B02进行截短。

9.一种如权利要求1～3任意一项所述与硼砂特异性结合的核酸适配体在识别硼砂试剂盒中的应用。