[发明专利]猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒及其制备方法和应用

说明书

发明公开了猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒及其制备方法和应用，包括猪肺炎支原体抗原蛋白包被的酶标板、参照样品、兔抗猪肺炎支原体阳性血清、兔抗猪肺炎支原体阴性血清。本发明试剂盒可对猪肺炎支原体抗原进行相对含量/效力测定，特异性好、重复性好，而且，所提供的固相竞争ELISA试剂盒操作简单，耗时短，不需要高端仪器设备，易于推广，适于疫苗生产检验及实验室研究应用。

技术领域

本发明涉及兽医技术领域，具体地说，本发明涉及一种猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia ofswine)又称猪喘气病、猪地方性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性呼吸道传染病，该病发病率高，死亡率低，普遍存在于世界各地。临床上以咳嗽、气喘和肺部典型的“肉样”或“虾肉样”病变为特征，患病猪生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。猪肺炎支原体主要通过感染破坏猪的呼吸道纤毛,导致纤毛脱落而引发肺炎,从而导致猪体的体液免疫和细胞免疫功能降低,产生免疫抑制,使其他细菌或病毒易感。目前该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。

测定蛋白质含量的方法有很多，如紫外分光光度法、凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法、BCA法、胶体金法、考马斯亮蓝染色法、银染法、荧光法等。每种方法都有其特点和局限性，比如，紫外分光光度法虽然简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用，但是该法准确度较差，干扰物质多，需要通过计算公式校正，一般用于层析柱的检测；凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大量样品的测定时不太合适；双缩脲法测定快速，操作简单，干扰物质较少，但是灵敏度太差，样品需要量大，测量范围窄；Lowry法因其灵敏度高，是过去应用最广泛的一种方法，但是其试剂配制较为困难，干扰物质很多，且需要精确控制操作时间，近年来逐渐被考马斯亮蓝法取代；考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度比Lowry法约高4倍，测定快速、简便，干扰物质少，缺点是用于不同蛋白质测定时仍有较大偏差，制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准物质以减少偏差，且标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，只能用标准曲线测定未知蛋白质的浓度；BCA法所用试剂、终产物稳定，几乎没有干扰物质影响，灵敏度高，近年来备受欢迎，多家公司开发了BCA试剂盒；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到微克水平，用于微量蛋白的测定。ELISA法因其敏感性高、特异性好、稳定性好，操作简单，目前成为检测的有效手段，在科研领域、基层得到广泛的应用。但是，目前国内还没有测定猪肺炎支原体抗原含量的ELISA试剂盒。

发明内容

针对上述技术问题，本发明用猪肺炎支原体全菌抗原蛋白包被酶标反应板，通过设立参照样品，阴阳性对照血清，建立了猪肺炎支原体抗原相对含量/效力测定的固相竞争ELISA法，并优化ELISA反应条件形成检测试剂盒，为猪肺炎支原体有效抗原含量定量测定奠定了基础。

本发明的第一个目的在于提供一种猪肺炎支原体抗原相对含量/效力检测的固相竞争ELISA试剂盒，第二个目的在于提供一种疫苗效力评价的方法，解决攻毒保护试验阴性猪难以寻找，攻毒试验耗时长的问题。

本发明采用的技术方案如下：

猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒，包括猪肺炎支原体抗原蛋白包被的酶标板、参照样品、兔抗猪肺炎支原体阳性血清、兔抗猪肺炎支原体阴性血清、10×浓缩洗涤液、样品稀释液/酶标抗体稀释液、TMB显色液和终止液。