[发明专利]基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法

权利要求书

1.基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

S1：制备双金属火山口表面增强拉曼散射衬底；

S2：蓝绿藻细胞混合培养；

S3：藻细胞表面增强拉曼散射光谱成像表征；

S4：建立藻细胞藻种表面增强拉曼散射光谱判别分析模型；

S5：基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究；

所述步骤S1具体为：在经过等离子体或化学方法清洗过的硅或玻璃硬质基底表面上，采用磁控溅射方法，依次镀金、银膜，金膜厚度为50-100纳米，银膜厚度为20-50纳米；其中，为提高金膜在基底表面的吸附性，在镀金膜前需镀2-3纳米的铬；

基于聚焦离子束刻蚀系统，采用氦源，选用10um光阑，束流大小为2pA，在镀贵金属膜硬质衬底上制备纳米孔阵列；其中，聚焦离子束剂量为14-20nC/μm²；纳米孔孔径为20-40纳米，周期为40-100纳米；

在氦离子束对上层银膜刻蚀时，氦离子与银原子相互作用，掺杂到银膜里面，产生两种作用力，一是溅射出银原子，二是促使银原子相互挤压，在纳米孔边沿形成凸起；溅射出的银原子在未被刻蚀的银膜表面电荷的作用下，重新沉积在未被刻蚀的银膜表面；待所述银膜被刻穿后，开始刻蚀金膜，刻蚀下层金膜过程中溅射出来的金原子，在未被刻蚀的银膜或纳米孔表面电荷的作用下，重新沉积在银膜未被刻蚀的表面及纳米孔四壁和纳米孔的边沿，构建双金属火山口表面增强拉曼散射衬底；其中，纳米金、银双金属层用于增强纳米孔附近单分子的拉曼散射信号，溅射沉积的金原子层用于防止银原子层的氧化；纳米孔边沿凸起间隙尺寸为20-40纳米，在纳米孔附近形成复合局域增强电磁场；

所述步骤S2具体为：

分别选取一种蓝绿藻种细胞进行灭菌扩大培养，在适宜的温度和光照下静止培养，每天摇动1～2次；待两种藻细胞处于稳定生长期，取相同数量的两种藻细胞进行混合培养；所述步骤S3具体为：

提取混合培养的藻液并稀释，取1ul稀释后的藻液滴到制备好的双金属火山口表面增强拉曼散射衬底上，藻细胞固定在火山口纳米孔或者火山口纳米孔边沿凸起间隙处，进而采用共聚焦显微拉曼光谱仪对藻细胞进行成像表征，获取藻细胞表面增强拉曼散射光谱；

所述步骤S4具体为：

建立不同藻种藻细胞的表面增强拉曼散射光谱标准数据库，基于判别式最小二乘算法、支持向量机或人工神经网络，建立藻种表面增强拉曼散射光谱判别分析模型；

所述步骤S5具体为：

利用步骤S2所述的蓝绿藻细胞混合培养方法，选择蓝绿藻种进行混合培养，并添加不同浓度的微囊藻毒素或蓝藻毒素，培养过程中隔天对混合藻液采样，采用步骤S3所述的方法对混合藻液进行表面增强拉曼散射光谱成像表征，并对藻细胞种类进行判别，分析不同浓度不同藻毒素诱导下藻细胞表面增强拉曼指纹特征演变规律，进而研究藻毒素在蓝绿藻种群竞争中的化感作用。

2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，其特征在于：

采用共聚焦显微拉曼光谱仪对藻细胞进行成像表征的参数为：选择532nm或785nm激光，激发功率不大于0.01mw，避免藻细胞光损伤，拉曼积分时间小于2秒，积分次数为1-5次，显微物镜放大倍数为50或100倍，拉曼成像扫描步长0.5-1um。