[发明专利]雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法

权利要求书

1.一种雄性不育基因OsDAF1的应用，其特征在于，所述雄性不育基因OsDAF1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示；所述应用为：通过RNA干扰或者序列变异基因工程方法由编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列突变获得序列如SEQ IDNO.3 所示的15个碱基对缺失导致关键氨基酸缺失的水稻雄性不育株系，即突变体Osdaf1-1；

或采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列移码并提前终止，突变为如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-3突变体。

2.一种水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，包括如下步骤：对常规水稻品种进行处理、培育，即得所述水稻雄性不育株系；

所述处理为：通过RNA干扰或者序列变异基因工程方法由编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列突变获得序列如SEQ ID NO.3 所示的15个碱基对缺失导致关键氨基酸缺失的水稻雄性不育株系，即突变体Osdaf1-1；

或采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列移码并提前终止，突变为如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-3突变体。

3.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述CRISPR-CAS9基因编辑方法中CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建方法包括如下步骤：

A1、选择OsDAF1基因编码区序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第393位至第413位共20bp的特异性片段为靶标位点；

A2、基于现有方法，采用两对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的序列作为引物，以质粒pGTR为模板，分别扩增出两段序列；混合两段序列，以限制性内切酶Bsa1和T7连接酶进行边切边连；产物作为模板，以如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的序列作为引物，扩增出tRNA连接gRNA的片段，Fok1限制性内切酶处理该片段后，插入Bsa1处理后的pRGEB32载体中，测序验证后成功构建pRGEB32-OsDAF1质粒，转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens）EHA105。

4.一种水稻不育株系在水稻制种中的用途，其特征在于，以如权利要求1所述应用获得的水稻雄性不育株系作为母本，配合具有杂交优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。

5.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用遗传手段将含OsDAF1 互补构建的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系，培育，进而使得突变体恢复野生型表型；其中OsDAF1 互补构建编码如SEQ ID NO. 1 所示氨基酸序列的如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：

B1、从野生型水稻幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，采用碱基序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物，扩增出OsDAF1基因的如SEQ ID NO.15所示的7234bp的基因组序列片段；

B2、提供携带表达OsDAF1互补构建载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105；其中，所述OsDAF1互补构建如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；

B3、将含OsDAF1互补构建的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得。