[发明专利]检测食用油中呕吐毒素的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

本发明为检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被呕吐毒素抗原的酶标板、呕吐毒素标准品、呕吐毒素抗体工作液、呕吐毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标板微孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下显色剂呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中呕吐毒素的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测待测样品中呕吐毒素的残留量。

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术领域，特别是检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素(vomitoxin)，主要是由镰刀菌的某些种产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物——单端孢霉烯族化合物中的一种。

DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。另外，它还常与其它的霉卤毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。近年来发现DON可能与人类食管癌、IGA肾病有关，对人类及动物的健康构成威胁。DON属于剧毒或中等毒物，研究表明，DON在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很强的细胞毒性。人畜摄入了被DON污染的食物／饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，但不同的动物对DON的敏感程度不一，猪是最敏感的动物。研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。

目前，呕吐毒素的测定方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、高效液相色谱-质谱联用法等，其检测结果准确可靠，但仪器设备比较昂贵，且样本前处理过程相对复杂。酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、呕吐毒素标准品、呕吐毒素抗体工作液、呕吐毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、呕吐毒素标准品的制备、呕吐毒素抗体工作液的制备、呕吐毒素酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由呕吐毒素抗原包被制备，具体步骤是将呕吐毒素半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将呕吐毒素包被抗原稀释成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

呕吐毒素标准品浓度分别为0 ng/mL、0.05 ng/mL、0.15 ng/mL、0.45 ng/mL、1.35ng/mL、4.05 ng/mL。

所述呕吐毒素抗体工作液是采用呕吐毒素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。