[发明专利]一种小分子蛋白自组装纳米复合物的制备及其在抗肿瘤领域的应用

说明书

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种小分子蛋白自组装纳米复合物的制备及在抗肿瘤领域的应用。本发明公开了这种纳米复合物的制备方法，首先通过静电吸附作用将聚阳离子鱼精蛋白与靶分子核酸适配体牢固结合，作为载体，再通过溶剂交换法载入药物双硫仑，制备纳米复合物，粒径小于200 nm，粒子分散均匀，稳定性良好，显著提高乳腺癌细胞对药物的摄取，增强药物对乳腺癌细胞的杀伤作用，本发明具体涉及小分子蛋白纳米复合物的构建及其在抗肿瘤方面的应用。

技术领域

本发明具体涉及一种小分子蛋白自组装纳米复合物的制备及其在抗肿瘤领域的应用，属于生物制药技术领域。

背景技术

双硫仑 (Disulfiram，DSF)又名戒酒硫，是目前应用最多的传统戒酒药物。它能够有效抑制乙醛脱氢酶的活性，阻断乙醛的氧化代谢，造成乙醛在体内聚积，从而达到戒酒的目的，同时具有较好的安全性，无明显的毒副作用。近年来，研究人员发现DSF有良好的抗肿瘤作用，能够杀伤包括直肠癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、乳腺癌及前列腺癌等多种肿瘤细胞。此外，DSF 能够螯合铜离子作为一种有效的蛋白酶体抑制剂，抑制蛋白激酶C、P-糖蛋白和DNA甲基转移酶等活性，诱导癌细胞凋亡。相较于传统的抗癌药物，DSF价格低廉，毒性低，应用前景广阔，但是其水溶性差和体内代谢过快等缺点限制了其在癌症临床治疗上的运应用。双硫仑结构式为：

核酸适配体(Aptamer, Ap)是一段人工合成的单链寡糖核苷酸片段，通常是一段DNA或RNA，通过互补序列的杂交形成复杂的三级或四级结构，可与多种目标物如蛋白质、抗生素等特异性结合发挥靶向识别能力。Ap具有高特异性、易修饰、高亲和性、高稳定性、无免疫源性等优点，使其在药物递送系统研究中得到了广泛的关注。目前的研究已经开发出多种靶向药物递送系统，在药物载体中，Ap用作靶向识别配体，特异性地递送药物至肿瘤部位，提高对肿瘤细胞的摄取能力，本发明引入能够特异性识别乳腺癌细胞的EpCAM核酸适配体，以期增强双硫仑的抗肿瘤作用。

DSF与Ap均具有负电荷，两者结合形成的纳米复合物不稳定，易解体，需引入带正电荷的材料用于保持整个纳米复合物的稳定，本发明采用了聚阳离子鱼精蛋白作为电荷结合物质。小分子鱼精蛋白(Protamine, Prota)是一种带强正电荷的细胞穿透膜，穿膜能力强，运载潜能大。同时，鱼精蛋白还包含一个核定位信号，有核靶向性，作为一种碱性蛋白,可与带负电荷的核酸分子紧密结合。

基于上述研究背景，本发明通过静电吸附作用将Prota与Ap牢固结合，作为递药载体，再通过溶剂交换法载入DSF，成功制备一种小分子蛋白自组装纳米复合物。制备得到的纳米复合物粒径小于200 nm，粒子分布均匀，稳定性良好，同时对乳腺癌细胞的摄取性能显著提高，为抗肿瘤纳米药物的研发提供新思路。

发明内容

本发明以鱼精蛋白与核酸适配体结合后形成的载体构建靶向递药平台，以自组装的方法载入药物双硫仑，所使用的核酸适配体分子为Anti-EpCAM aptamer (5’- CAC TACAGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG-3’)，通过适配体的靶向识别功能和纳米复合物在肿瘤组织的高通透性和滞留效应使得药物大量富集于肿瘤部位，发挥治疗作用。

为了达到该发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种小分子蛋白自组装纳米复合物的制备方法，首先基于正电荷的鱼精蛋白Prota与负电荷的适配体核酸分子Ap，通过静电吸附作用形成稳定纳米载体Ap-prota，再通过溶剂交换法将双硫仑DSF与纳米载体自组装成双硫仑/适配体-鱼精蛋白纳米复合物DSF/Ap-prota。

具体包括如下步骤：

（1）称取2 mg的双硫仑溶解于1mL甲醇中，配制得到浓度为2 mg/mL的双硫仑储备液，备用；