[发明专利]一种稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4的重组载体和表达方法

说明书

本发明公开了一种稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4的重组载体，本发明还公开一种稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4的表达方法。本发明构建了稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4的原核表达载体，并且针对蛋白表达条件进行一系列的优化，最终得到MoCCG4可溶性蛋白，其结果为进一步研究蛋白晶体结构和生物学特性奠定基础，为设计针对MoCCG4为靶标的农药研制提供思路，进而为稻瘟病的防治提供依据。

技术领域

本发明涉及一种稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4的重组载体和表达方法，属于生物技术领域。

背景技术

水稻是最重要的粮食作物之一，全球大约一半的人口以水稻为主要粮食。然而，由稻瘟菌侵染水稻引起的稻瘟病却严重威胁着水稻的生产。目前，稻瘟病的控制主要依靠种植抗病品种和使用化学农药等防治措施。但是，由于稻瘟菌生理小种遗传群体的复杂性和易变性，当一个新的抗病品种大面积推广种植3～5年后，新的致病类型就会产生，从而造成抗病品种抗性丧失，再次导致稻瘟病的爆发和流行。此外杀菌剂等化学农药的长期使用不仅使稻瘟菌出现抗药性，也使稻瘟菌防治成本的节节攀升，还导致了环境的不断恶化。因此，水稻生产面临急需环保、安全的新型稻瘟病防治策略。如何有效防治稻瘟病一直是水稻安全生产面临的最实际的问题，了解稻瘟病病原菌的生长、发育的机制和致病相关的分子调控机理是控制该病害的前提。

生物钟是生物体随外界环境做周期性变化的一种现象，而生物钟节律则源于生物体内的生物钟基因。生物钟控制基因是控制生物钟的特殊基因，它们相互作用控制其他基因时而活跃时而沉寂，形成睡眠节奏。生物钟虽然是生物体内部的生理进程，但是与外界环境也是紧密联系的，能够使生物体更好地适应外界环境条件的变化。因此，研究稻瘟菌的生物钟控制基因对于了解稻瘟菌的生长、发育是必要的。目前稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4已被发现，但如何将其以可溶性形式表达出来以进行下一步研究尚是本领域的难题。

基因的原核表达是研究基因功能的常用技术之一。蛋白原核表达时常常存在大肠杆菌中由于稀有密码子造成表达限制，形成包涵体；毒性较强的蛋白表达时会抑制蛋白的表达，造成表达产量过低；另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，导致表达产物不溶。针对上述难题，通常的做法是将包涵体用尿素溶解后在变性的情况下进行纯化，然后复性。但此方法步骤繁琐，成功率低。本发明通过选用不同的细菌菌株、采用不同的诱导温度以及诱导剂IPTG的浓度来筛选MoCCG4蛋白可溶性表达的条件，为基因功能学、蛋白质晶体等研究打下基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4的重组载体和表达方法。

本发明的技术方案是：一种稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4的重组载体，所述重组载体的制备方法如下：提取稻瘟菌的RNA，并反转录出cDNA；以cDNA为模板扩增MoCCG4基因；将MoCCG4扩增产物经BamHI和NotI双酶切后，通过DNA连接酶插入到经同样双酶切的pET-28a表达载体中，得到重组质粒pET-28a-MoCCG4。

优选地，以cDNA为模板，利用以下引物扩增MoCCG4基因，引物序列如下：

上游引物：MoCCG4-F：GCGGATCCATGGCCATCGTCAACGC下划线为BamHI酶切位点；

下游引物：MoCCG4-R：CGGCGGCCGCTCAAGAATGGTCGAGAAGCCT下划线为NotI酶切位点；

上下游引物分别如SEQ ID NO.3、4所示。

本发明还提供一种表达稻瘟菌生物钟控制基因MoCCG4的方法，包括以下步骤：

(1)用权利要求1或2所述的重组载体转化大肠杆菌细胞，得到表达MoCCG4的重组原核表达菌株；