[发明专利]一种唾液酸诱导表达元件及应用

说明书

本发明公开了一种唾液酸诱导表达元件及应用，属于遗传工程领域。本发明以pHT质粒为载体，在枯草芽孢杆菌中，P_ydjO启动子表达转录调控蛋白NanR，优化整合NanR识别结合序列的强启动子P_veg，实现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168在含有唾液酸的环境下极低水平的泄漏表达，可使泄露表达率降低至2％左右，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种唾液酸诱导表达元件及应用，属于遗传工程领域。

背景技术

在枯草芽孢杆菌中，可诱导激活表达的启动子元件，广泛应用于代谢工程领域。目前，枯草芽孢杆菌中常用的诱导启动子，有木糖诱导启动子P_xyl和IPTG诱导启动子P_grac。然而，木糖诱导启动子P_xyl的诱导剂木糖可被枯草芽孢杆菌代谢消耗，IPTG诱导启动子P_grac的诱导剂IPTG对细胞存在一定毒性的问题。尤其是，木糖和IPTG诱导启动子存在较高的泄漏问题。以上缺陷，严重限制了其在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。唾液酸作为一种简单碳源，且对细胞无毒，且不会被枯草芽孢杆菌代谢消耗，是一种合适的诱导物。通过基因工程改造启动子，可以获得基于唾液酸诱导的更合适于枯草芽孢杆菌的响应元件。然而，如何改造启动子，以降低其泄漏表达是一个值得深入研究的问题。另外，枯草芽孢杆菌缺失唾液酸天然转运途径，不能转运胞外唾液酸至胞内，这也限制了唾液酸诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，构建响应于唾液酸的诱导表达启动子元件，本发明以组成型启动子P_ydjO或强启动子P_hbs表达转录调控蛋白NanR，进一步通过在组成型启动子P_veg中，整合转录调控蛋白NanR结合序列TTNANNTGGTATAACAGGTATANAGNTANNNNNTNN，实现添加唾液酸后，表达元件在枯草芽孢杆菌BSNanT中的诱导表达。进一步通过更换NanR启动子P_ydjO为强启动子P_hbs，在P_veg启动子中进一步增加一个拷贝的NanR结合序列，实现唾液酸响应元件在无唾液酸添加时极低的泄漏表达量。

本发明的第一个目的是提供一种响应唾液酸的诱导表达启动子元件；含有(a)或(b)；

(a)组成型启动子P_ydjO、转录调控蛋白NanR、组成型启动子P_veg、转录调控蛋白NanR结合序列，所述组成型P_ydjO启动子表达转录调控蛋白NanR；所述组成型启动子P_veg整合有转录调控蛋白NanR结合序列；所述启动子P_ydjO和P_veg反向连接；

(b)组成型启动子P_hbs、转录调控蛋白NanR、组成型启动子P_veg、两个拷贝的转录调控蛋白NanR结合序列，所述组成型P_ydjO启动子表达转录调控蛋白NanR；所述组成型启动子P_veg整合转录调控蛋白NanR结合序列；所述启动子P_ydjO和P_veg反向连接。

在本发明的一种实施方式中，所述组成型P_ydjO启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，转录调控蛋白P_hbs启动子的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，NanR结合位点序列的核苷酸序列如SEQ NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，转录调控蛋白NanR氨基酸序列如SEQ NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，唾液酸转运蛋白NanT氨基酸序列如SEQ NO.5所示。