[发明专利]一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用

说明书

一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用，所述浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株也称为12号基因簇敲除菌（Saccharopolyspora pogona‑△cluster12），于2019年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019070。将本发明浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株应用于丁烯基多杀菌素的生物合成，与利用原始菌株S.pogona进行丁烯基多杀菌素的生物合成相比，丁烯基多杀菌素的产量提高6倍以上。

技术领域

本发明涉及一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用。

背景技术

使传统化学农药是当前控制农业病虫害的主要方法，但是，长期依赖和大量使用化学农药，对环境造成了严重的破坏，食品安全也无法得到保障。随着人们环保意识的增强和生活品质的提高，生物农药因其选择性强、不伤害天敌、无污染和不易产生抗性等优点，越来越受到人们的关注。

丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是由须糖多孢菌 (Saccharopolyspora pogona)产生的一类与多杀菌素结构类似的大环内酯类抗生素。到目前为止，丁烯基多杀菌素组分共检测到 31 种，这类化合物具有很好的防治农林害虫、卫生害虫和线虫的作用，是当今世界上最具发展前景的新型生物农药之一。然而，现有丁烯基多杀菌素产生菌的发酵产量低，生长周期长，限制了这一绿色生物农药的工业化生产和推广应用。因此，提高丁烯基多杀菌素产量对于农业害虫防治及生物安全具有重要的意义。

2018年，Li等人首次通过基因工程技术完成对须糖多孢菌聚核苷酸磷酸激酶基因(pnp)研究，并获得高产突变株，使得利用基因工程技术对须糖多孢菌基因组进行定向遗传修饰成为提高丁烯基多杀菌素产量的有效方法（Impact on strain growth and butenyl-spinosyn by overexpression of polynucleotide phosphorylase gene inSaccharopolyspora pogona, Li L等，102（18）：8011-8021，2018）。但效果尚欠理想。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，旨在利用该浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株进行丁烯基多杀菌素的生物合成，提高丁烯基多杀菌素生物合成的产量，降低丁烯基多杀菌素生产成本。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株该浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，即12号基因簇敲除的工程菌株，也即须糖多孢菌S. pogona-△cluster12，Saccharopolyspora pogona-△cluster12，于2019年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武昌区，武汉大学)，菌种保藏编号为CCTCC NO:M2019070。

所述浅黄霉素基因簇，为须糖多孢菌基因组聚酮合成基因簇，其基因簇序列如序列表SEQ ID№.1所示。

本发明之浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株的构建方法如下：

（1）提取须糖多孢菌NRRL 30141基因组，分别扩增1 Kb大小的浅黄霉素基因簇上下游同源臂；

（2）将sgRNA与上下游同源臂进行融合，与质粒pKCcas9dO进行酶连，获得重组质粒pKCcas9-sgRNA-UHA-DHA;

（3）接合转移构建工程菌株S. pogona-△cluster12及其PCR鉴定；