[发明专利]包被液和原代肿瘤细胞的分离培养方法

说明书

本发明提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法，该用于促进细胞贴壁的包被液，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO₃以及HEPES组成的混合液。本发明提供的方案实现了从较小的组织样本中分离培养原代肿瘤细胞。

技术领域

本发明涉及细胞体外培养技术领域，特别涉及一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法。

背景技术

随着人们生活水平的日益改善，肿瘤患者日益增加，且呈年轻化趋势。为研究其发病机制和治疗，目前已建立了不同肿瘤的肿瘤细胞株。但经过长期培养，肿瘤细胞株的生物学特异性发生变异，不利于其癌变、分子遗传、免疫学特性以及浸润转移演变机制等的研究。

对于原代培养的肿瘤细胞来说，其生物学特性未发生很大变化，仍保留原二倍体遗传性，基因保留量在90％以上，适用于药物敏感性试验及机制探究相关试验。另外，通过原代培养技术建立相应的肿瘤细胞库，可为日益深入的肿瘤研究及治疗提供充足有效的细胞来源。因此，建立合理、稳定、高效的肿瘤细胞原代培养模式已成必然。

由于原代肿瘤细胞的培养过程过于复杂、贴壁速度慢、细胞数量少、纯度低且培养困难等，现有的原代肿瘤细胞的培养方法，往往需要采用比较大的组织样本进行培养。而很多情况下获得的组织样本并不能满足现有的培养方法的需求，也就是说，对于具有组织样本小，混杂成纤维细胞以及微生物多样性等特点的肿瘤细胞组织如肠癌细胞组织、胃癌细胞组织等来说，现有的一些原代肿瘤细胞培养基很难用来培养原代肿瘤细胞。因此，开发针对较小的组织样本的促进细胞贴壁的包被液以及分离培养方法则显得十分重要。

发明内容

本发明实施例提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法，实现了从较小的组织样本中分离培养原代肿瘤细胞。

一方面，一种用于促进细胞贴壁的包被液，包括：

混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，所述包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，所述包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO₃以及HEPES组成的混合液。

优选地，

所述Ⅰ型胶原蛋白、所述包被液Ⅱ以及所述包被液Ⅲ的体积比为8:1:1。

优选地，

所述包被液Ⅲ为40-100mM NaOH、200-300mM NaHCO₃以及100-250mM HEPES组成的混合液。

另一方面，一种原代肿瘤细胞分离培养方法，包括：

将权利要求1至3任一所述的包被液均匀铺于细胞培养容器中，并将铺有包被液的细胞培养容器置于37℃细胞培养箱中1～2h，制得包被的细胞培养容器；

通过清洗液清洗肿瘤组织；

顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理；

顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞；

当培养细胞的细胞汇和度达到70～90％时，基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞。

优选地，所述顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理，包括：

在1-2ml DF培养基内，将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状；

将碎泥状的肿瘤组织转移至离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，第一次离心3～5min，移除上清；