[发明专利]检测生物膜蛋白质间相互作用的方法及所用成套试剂

说明书

本发明公开了检测生物膜蛋白质间相互作用的方法及所用成套试剂。本发明公开的检测生物膜蛋白质间相互作用的方法包括：连接蛋白质X与Y，得到X‑Y；连接蛋白质Y_L与R，得到Y_L‑R；Y与Y_L间具有相互作用，R能驱动相分离产生相变液滴；连接X_L与报告基团J得到X_L‑J；向生物细胞中导入X‑Y的编码基因，使X‑Y的编码基因得到表达，得到重组细胞，X‑Y定位于生物膜上；向重组细胞的培养体系中加入Y_L‑R和X_L‑J，检测J的信号是否在R形成的相变液滴中聚集，确定X和X_L间是否具有相互作用。本发明的方法操作简便、灵敏度高、成本低廉、适用性广。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，检测生物膜蛋白质间相互作用的方法及所用成套试剂。

背景技术

“相变”作为物质的一种特性在物理界及日常生活中早已广为人知，近几年科学家们逐渐发现相变(或相分离)机制也广泛存在于生物细胞中，且在细胞生命活动中行使重要的生物学功能。

相关研究发现，具有特定结构的生物大分子在一定浓度下可因相互作用而高度聚集，从而从一般溶液相中分离出来，形成一个大分子富集的独立的相(称为第二相，以区别于原溶液相)，这个现象被称为“相变”(或“相分离”)。在显微镜下可见第二相内含有大量聚集产物(小液滴或固体颗粒或凝胶状物等)，其直径可达微米级甚至更大，具有较高的辨识度。

在生物细胞中，越来越多的研究发现含有低复杂度结构域(low-complexitydomain，简称LCD)的蛋白可驱动相分离的发生，产生相变液滴。低复杂性结构域是一种富含或仅由少数类型氨基酸组成的蛋白质片段，这些片段的组合通常遵循简单模式，如串联重复等。LCD蛋白在生物体中广泛存在，并在细胞信号转导、蛋白质互作网络中发挥重要作用。研究发现，与神经退行性疾病密切相关的FUS(fused in sarcoma)蛋白的LCD结构域可介导相变发生。

蛋白质间的相互作用是一切生命活动的基础,研究蛋白互作及调控是了解蛋白质功能和解析相关信号通路的重要手段，也有助于潜在药物靶点的开发。相对于细胞质中蛋白质的相互作用，检测位于细胞膜和细胞器膜上的蛋白质的相互作用面临着更大的挑战，包括膜结构上的蛋白不易提取，相互作用时间短且作用力弱等，鉴定蛋白互作的传统方法往往难以检测膜蛋白互作。如经典的免疫沉淀技术适用于非跨膜蛋白，跨膜蛋白表达纯化后由于脱离了膜环境而使其空间结构发生改变，影响到其蛋白功能并进而影响免疫沉淀效果。旨在研究膜蛋白互作的分离泛素酵母双杂交(DUALmembrane)系统则因过高的假阳性结果而需要后续繁琐的鉴定工作。近年来发展起来的以BioID、APEX和PUP-IT为代表的蛋白邻近催化标记技术，通过在诱饵蛋白上融合具有邻近标记功能的酶可实现对膜蛋白间相互作用的鉴定，然而这种技术存在的普遍问题是酶的自我修饰难以避免，且这种自我修饰可能会因抑制酶的活性或耗尽底物而对实验结果造成影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测生物膜蛋白质间或生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间的相互作用以及进一步如何鉴定或筛选这些蛋白质间互作的调控因子。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测蛋白质间相互作用的方法，待测蛋白质名称为X和X_L，所述X为生物膜蛋白质，所述方法包括U1)和U2)：

U1)连接所述X与名称为Y的蛋白质，将得到的重组蛋白记为X-Y；连接名称分别为Y_L与R的蛋白质，将得到的重组蛋白记为Y_L-R；所述Y与所述Y_L间具有相互作用，所述R能驱动相分离产生相变液滴；连接所述X_L与名称为J的报告基团，将得到的重组分子记为X_L-J；