[发明专利]一种高纬度地区马铃薯原原种繁育方法

权利要求书

1.一种高纬度地区马铃薯原原种繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)茎尖脱毒组织获得：在田间根据植株长势，选择高纬度地区马铃薯的健康单株；之后将所述健康单株的薯块在36℃条件下进行催芽4～6周，待所述薯块催芽萌发至芽长1.0～2.0cm时，剥离所述芽直到只保留一个叶原基生长点，且所述叶原基生长点大小为0.1～0.3mm；之后将所述叶原基生长点切下，置于装有基本培养基的1号培养瓶中，封严所述1号培养瓶的瓶口放于培养室内培养，直至长出小植株；

(2)病毒检测：采用RT-PCR法对步骤(1)中制备的所述小植株进行病毒检测，筛选得到不含病毒的小植株，称为脱毒小植株；

(3)脱毒试管苗快速繁殖：将所述脱毒小植株在无菌条件下按茎节切段，获得茎节段；之后将所述茎节段置于装有快速繁殖培养基的2号培养瓶内，在23～25℃、光照强度3000Lx、光照时间16h/d条件下培养15～20d，获得具备移栽条件的试管苗；所述快速繁殖培养基的成分组成是Ms大量元素、微量元素、铁盐、20g/L蔗糖或白糖，pH值5.8，不含有机物和植物激素；每个所述2号培养瓶内培养15～30个所述茎节段；

(4)网棚起垄生产原原种：移栽前5～7d，将培养试管苗的所述2号培养瓶瓶盖打开，置于培养室内进行炼苗；之后移栽至整理好的苗床上培养10～15d，之后将其假植于育苗钵里培养10～15d，得到假植苗；之后根据所述假植苗的长势，及时移栽定植于整理好的大棚内，进行微喷灌溉，扣上防虫网，并在生长过程中进行3～4次中耕培土、2～3次人工除草、及时灌溉、病害防治；成熟后进行机械杀秧和收获，之后进行包装贮藏。

2.根据权利要求1所述的一种高纬度地区马铃薯原原种繁育方法，其特征在于，步骤(1)所述剥离芽直到只保留一个叶原基生长点的操作过程为：取粗壮的芽段用无菌水冲洗40min，再用75％的酒精浸蘸3s，放入无菌杯内用0.1％的HgCl水浸泡30s，然后用无菌水冲洗4次，之后将茎尖放在无菌滤纸上吸干水分，在30～40倍解剖镜下用解剖针由外向里逐层将生长点的小叶片和叶原基剥离，直到只保留一个叶原基生长点；步骤(1)中所述封严1号培养瓶的瓶口放于培养室内培养的条件为：温度23～25℃、光照强度2000～3000Lx，光照时间16h/d，培养周期120～140d。

3.根据权利要求1所述的一种高纬度地区马铃薯原原种繁育方法，其特征在于，步骤(2)中所述RT-PCR法的检测过程为：提取纯化所述小植株的RNA为模板，加入Oligo(dT)，进行反转录生成cDNA；之后以所述cDNA为模板，用特异性引物，进行PCR扩增得到扩增产物；之后对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带中不含病毒特异条带的样品对应的小植株即为脱毒小植株。

4.根据权利要求1所述的一种高纬度地区马铃薯原原种繁育方法，其特征在于，步骤(2)中所述病毒检测的病毒种类为马铃薯常见的六种病毒PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA，使用的特异性引物序列分别为：

PVX上游引物5'-AGTGGTATGGAACTGGATG-3'，

PVX下游引物5'-TTATGGTGGTGGTAGAGTGA-3'；

PVY上游引物5'-CATGGGAAATGACACAATCG-3'，

PVY下游引物5'-TCACATGTTCTTGACTCCAAG-3'；

PLRV上游引物5'-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3'，

PLRV下游引物5'-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3'；

PVS上游引物5'-AATGCCGCCTAAACCAGATC-3'，

PVS下游引物5'-AACGGTCTGCCTTCATTGGT-3'；

PVM上游引物5'-CGCATACAATATCTGGACTTACAC-3'，

PVM下游引物5'-CTACTCCAGTAATGCAACTCATC-3'；

PVA上游引物5'-GAACTCTTGATGCAGGCG-3'，

PVA下游引物5'-ACATCCGTTGCTGTGTGTCC-3'。