[发明专利]构建强力霉素/米非司酮诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体及构建方法及应用，所述表达载体系统核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中表达载体系统可以在几乎所有生物和细胞中正常表达且无渗漏表达，避免了基因沉默以及转导病毒可能带来的细胞毒性和免疫反应，系统特异性高，安全性高，诱导效率高，诱导具有可逆性，可以用多种转染方法进行转基因操作。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种构建强力霉素/米非司酮(Doxycycline/Mifepristone)诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体及构建方法及应用。

背景技术

目前已知的基因过表达载体有慢病毒载体、类腺病毒载体、转座子载体、非整合质粒等等，其中整合载体是最适合构建稳定转基因细胞系或模式动物的基因过表达载体，慢病毒载体和转座子载体PiggyBac是目前公认最有效的整合载体。

慢病毒载体在高滴度条件下几乎可以转染全部目标细胞，侵染及整合效率高。但它也有一些缺点：存在物种特异性，一般而言只能转染人类细胞，应用面有限；载体本身体积大而有效容量小，分子遗传学操作困难；部分基因序列包装困难；慢病毒载体整合到基因组后可能只在少数细胞群中有表达，很容易被沉默，基因表达水平不高。

慢病毒载体中的pTRIPZ载体系统(Invitrogen公司)，其Tet-on过表达系统表现优异：目标基因的启动子是CMV，反式激活因子的启动子是pUbC，二者没有物种及细胞型的表达特异性，应用面广。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种构建强力霉素/米非司酮(Doxycycline/Mifepristone)诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体及构建方法及应用，表达载体系统可以在几乎所有生物和细胞中正常表达且无渗漏表达，避免了基因沉默以及转导病毒可能带来的细胞毒性和免疫反应，系统特异性高，安全性高，诱导效率高，诱导具有可逆性，可以用多种转染方法进行转基因操作。

解决以上技术问题的本发明中的一种构建强力霉素/米非司酮 (Doxycycline/Mifepristone)诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体，其特征在于：所述表达载体系统核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明中一种构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)以pSwitch为模板构建反式元件载体PB-Gal4-Teton-trans-vector；

(2)以GeneV5-His B为模板构建顺式表达载体PB-Gal4-Teton-cis-vector；

(3)将以上步骤(1)和步骤(2)元件和其它辅助载体(PB200PA-1)载体组合在一起构建成一套双诱导过表达载体系统。

本发明中根据已有的基于PiggyBac的PB-tet-on-OE(Tet-on系统)和pSwitch和GeneV5-His B载体系统(Gal4/RU486系统)(均是Invitrogen载体或其衍生载体)，通过分子克隆构建崭新的双诱导过表达系统。由于元件过大过多，将分别构建反式元件载体和顺式元件载体，分别包含Tet-on系统和Gal4/RU486系统的全部反式元件和顺式元件。

本发明中构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体的方法，具体包括如下步骤：

步骤一：反式元件载体PB-Gal4-Teton-trans-vector的构建：