[发明专利]全细胞催化生产5-氨基戊酸的工程菌及5-氨基戊酸的制备方法

说明书

本发明涉及一种全细胞催化生产5‑氨基戊酸的工程菌及5‑氨基戊酸的制备方法。该工程菌与出发菌相比，具有γ‑氨基丁醛脱氢酶abD基因、赖氨酸脱氢酶cadA基因和丁二胺氧化酶puO基因的表达。本发明通过γ‑氨基丁醛脱氢酶abD，赖氨酸脱氢酶cadA，丁二胺氧化酶puO表达组合优化和最适宿主菌的选择，构建高催化速率和高催化浓度的5‑氨基戊酸全细胞催化工程菌。

技术领域

本发明总地涉及生物技术领域，具体涉及全细胞催化生产5-氨基戊酸的工程 菌及5-氨基戊酸的制备方法。

背景技术

5-氨基戊酸(5-aminovalerate,5AVA)是一种奇数碳的功能单体原料，可通过 分子内脱水环化生产δ-戊内酰胺(2-piperidone)，进一步加工成为生物基尼龙-5 和尼龙-65。

聚酰胺(Polyamide,PA)俗称尼龙(Nylon)，包括由同一种分子形成的单聚 物及由二元胺或二元酸为单体形成的共聚物等不同形式，在纺织、汽车、电子电 器、生物塑料和医药等行业有广泛的应用。世界上主要通过石化原料生产聚酰胺， 全球每年需要消耗约700万吨的聚酰胺产品，且呈现逐年增长的趋势，造成能源 资源短缺、生态环境恶化等问题。目前，广泛使用的聚酰胺PA6和PA66产品是 由己二酸和己二胺聚合而成，其中己二酸可以通过微生物法合成，而己二胺依赖 于传统的石油化工合成。研究发现以五碳平台化合物(5-氨基戊酸、5-氨基戊酸和 戊二酸等)为主要原料生产的新型尼龙PA5X系列产品，具有良好的流动性、较 高的力学和热学性能以及本质阻燃性，可以替代PA66。因此，利用可再生的物质资源，开展其它的五碳平台化合物的生物合成研究，对于开发新型的生物基聚 酰胺、聚氨酯等高分子聚合物具有重要的经济学和生态学意义。

目前工业上制备5-氨基戊酸主要使用化学法合成，一般采用戊内酰胺或戊内 酰胺聚合物(尼龙6的熔块、废丝、废弃织物、渔网等)水解后精制而得，其反 应条件苛刻，能耗大，设备腐蚀大，效率低，分离复杂。为取代化学合成法，研 究人员积极探索开发条件温和，转化高效的5-氨基戊酸的生物合成路线。生物法 合成目前主要有发酵法和催化法两种。

发酵法生产5-氨基戊酸主要通过在大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌中构建5-氨基 戊酸合成途径实现从葡萄糖合成5-氨基戊酸。Park等人在大肠杆菌中人工构建了 由davB-davA催化的5-氨基戊酸合成途径，利用代谢工程改造胞内代谢途径，解 除天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸的反馈抑制作用，敲除cadA基因阻断赖氨酸到 5-氨基戊酸的转化，能够合成0.86g/L5-氨基戊酸，首次建立了从葡萄糖转化为5- 氨基戊酸的合成路线。通过进一步优化代谢网络和培养条件，构建的大肠杆菌工 程菌通过添加20g/L葡萄糖发酵能够产生3.6g/L5-氨基戊酸。Shin等人通过对来 源于恶臭假单胞菌的davB和davA基因的密码子进行优化，利用具有不同转录强 度的启动子共表达的方式，在谷氨酸棒杆菌中实现了摇瓶发酵产6.9g/L 5-氨基戊 酸。进一步阻断5-氨基戊酸转化为戊二酸，5L发酵罐的5-氨基戊酸产量提高到 33g/L。Jorge等人通过在谷氨酸棒状杆菌中引入大肠杆菌的赖氨酸脱氢酶(LdcC), 戊二胺转氨酶(PatA),γ-氨基丁醛脱氢酶(PatD)，将对应的基因ldcC,patA,patD整合至谷氨酸棒状杆菌的染色体上，通过发酵法生产5-氨基戊酸，最终产量达到5.1g/L。

与发酵法相比，全细胞催化的5-氨基戊酸生物合成是利用赖氨酸作为底物， 直接转化生产5-氨基戊酸。这样的生物合成路线更具有竞争力和经济性。全细胞 催化法目前在大肠杆菌中通过异源表达来源于恶臭假单胞菌KT2440的davB基因 编码的赖氨酸2-单加氧酶和davA基因编码δ-戊酰胺酶，全细胞催化12小时可以 将30g/L赖氨酸催化转化为20.8g/L的5-氨基戊酸。通过高密度发酵培养，可以 将60g/L赖氨酸催化转化生成47.96g/L的5-氨基戊酸。目前，5-氨基戊酸生物催 化的现有技术存在工程菌细胞催化性能低，产量水平与实现工业化应用存在较大 差距。挖掘不同催化性能的酶，利用大肠杆菌作为宿主细胞，组建不同的催化途 径，构建新的全细胞催化工程菌催化生产5-氨基戊酸，有助于5-氨基戊酸生物催 化的工业化生产。