[发明专利]川桑色氨酸羟化酶T5H2及其应用

说明书

本发明公开了川桑色氨酸羟化酶T5H2及其应用，其中川桑色氨酸羟化酶T5H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，含有532个氨基酸，PI＝4.93，将川桑色氨酸羟化酶T5H2基因克隆后构建原核表达系统，表达后进行酶活测定，测得具有较高的色氨酸羟化酶活性，因此川桑色氨酸羟化酶T5H2可以作为工程菌的基因，表达的重组川桑色氨酸羟化酶T5H2也可以作为体外催化色胺转化为5‑色胺的催化剂，然后过不同的途径有效的合成相应产物，最后有效的合成褪黑素，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及川桑色氨酸羟化酶T5H2，还涉及川桑色氨酸羟化酶T5H2及其应用的应用。

背景技术

褪黑素，学名N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，是一种吲哚胺，色氨酸的代谢产物。目前已知它广泛存在于人体、动物体及植物体内，生理作用非常广泛。由于其首先在人体的松果体内被发现，因此又被称为松果体素。随后的研究发现，其广泛存在于人体内的各个部位，含量极少，只有pg(1×10^-12g)/mL水平。目前已知的褪黑素的生理功能主要有调节生物体的昼夜节律，缓解睡眠障碍；抗氧化，褪黑素本身及其代谢产物不仅有强大的自由基清除能力，而且能够诱导生物体相关抗氧化酶活性增强，增强免疫作用，抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病有明显效果等优点。

长期以来褪黑素被认为是动物体内专有的，自从1995年在植物中检测到褪黑素之后，人们陆续在许多高等植物中也发现褪黑素存在。在动物中，褪黑素的生物合成途径已经非常清楚。在植物中褪黑素的合成途径包括3条：(1)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(2)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰色胺氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(3)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将5-羟色胺转化成5-甲氧基-色胺；N-乙酰色胺转移酶将5-甲氧基-色胺转化成褪黑素。

色氨酸羟化酶基因(T5H2)是褪黑素合成过程中的第二个限速酶，该反应高度特异，是褪黑素合成中的重要酶促步骤。川桑中含有褪黑素，但是其含量极低，并不能大量提取获得。因此，研究褪黑素合成途径的色氨酸羟化酶基因及其基因，有利于体外合成途径的建立，为褪黑素规模化生产点奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明通过分子生物学技术，克隆出褪黑素合成相关酶色氨酸羟化酶T5H2基因，分析该基因的核苷酸和翻译的氨基酸序列，采用大肠杆菌原核表达系统进行褪黑素合成相关酶色氨酸羟化酶T5H2的功能验证。用发酵的产物纯化、得到相关的色氨酸羟化酶蛋白直接体外依次合成褪黑素前体5-羟色胺。即本发明的目的之一在于提供一种川桑色氨酸羟化酶T5H2；本发明的目的之二在于提供一种川桑色氨酸羟化酶基因T5H2；本发明的目的之三在于提供所述川桑色氨酸羟化酶T5H2在制备色胺转化为5-羟色胺的催化剂中的应用；本发明的目的之四在于提供所述川桑色氨酸羟化酶基因T5H2在原核生物中重建褪黑素合成途径中的应用；本发明的目的之五在于提供一种制备重组川桑色氨酸羟化酶T5H2的方法；本发明的目的之六在于提供由权所述的方法制得的重组川桑色氨酸羟化酶T5H2；本发明的目的之七在于提供所述重组川桑氨酸羟化酶T5H2在制备色胺转化为5-羟色胺的催化剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种川桑色氨酸羟化酶T5H2，所述色氨酸羟化酶T5H2的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

优选的，编码川桑色氨酸羟化酶T5H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、一种川桑色氨酸羟化酶基因T5H2，所述川桑色氨酸羟化酶基因T5H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。