[发明专利]一种用斑马鱼缺血性脑卒中模型评价脑卒中治疗剂的方法

权利要求书

1.一种斑马鱼缺血性脑卒中模型的建立方法，包括如下步骤：

(1)斑马鱼最佳发育阶段的确定

取基因突变型Albino品系斑马鱼亲本交配、孵化，选择不同发育阶段的斑马鱼分别移入微孔板；

根据不同的发育阶段将对应的微孔板设置如下实验组：诱导剂处理组，该组中对斑马鱼水溶给药单浓度的诱导剂；正常对照组，该组中对斑马鱼不进行任何处理；然后，各实验组均加入相同体积的养鱼用水，在相同温度下恒温培养；

当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，将实验组的斑马鱼置于心跳血流分析系统，分析斑马鱼脑部供血量和血流速度，判断并确定斑马鱼的最佳发育阶段；

所述不同发育阶段的斑马鱼为2～4dpf的斑马鱼；所述最佳发育阶段的斑马鱼为2dpf的斑马鱼；

(2)诱导剂最佳给药浓度的确定

将步骤(1)确定的2dpf斑马鱼移入微孔板中，设置如下实验组：正常对照组和不同给药浓度的诱导剂处理组；正常对照组中对斑马鱼不进行任何处理，诱导剂处理组中对斑马鱼水溶给药不同浓度的诱导剂；然后，各实验组均加入相同体积的养殖用水，在相同温度下恒温培养；

当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，各实验组中加入邻联茴香胺染色液，对染色处理后的斑马鱼脑部位置拍照并保存，统计脑卒中发生率，判断并确定诱导剂的最佳给药浓度；

所述诱导剂的给药浓度为0.5～10μg/mL，所述诱导剂的最佳给药浓度为2.5μg/mL；

所述步骤(1)、步骤(2)中的诱导剂，为普纳替尼。

2.根据权利要求1所述的斑马鱼缺血性脑卒中模型的建立方法，其特征在于，所述的养鱼用水条件为：溶解氧质量浓度为6～8mg/L；水温为28℃；pH为7.2～7.6；总硬度为200～250mg/L。

3.根据权利要求1所述的斑马鱼缺血性脑卒中模型的建立方法，其特征在于，所述的恒温培养条件为：微孔板置于恒温培养箱中，在28℃下培养4～6h。

4.一种如权利要求1～3任一所述的建立方法得到的斑马鱼缺血性脑卒中模型的用途，其特征在于，用于筛选或评价已知或未知的脑卒中治疗剂。

5.根据权利要求4所述的斑马鱼缺血性脑卒中模型的用途，其特征在于，所述的脑卒中治疗剂为阿司匹林、氯吡格雷。

6.一种用如权利要求1～3任一所述的建立方法得到的斑马鱼缺血性脑卒中模型筛选或评价脑卒中治疗剂的方法，包括如下步骤：

选取处于2dpf的斑马鱼移入微孔板中，设置如下实验组：正常对照组，该组中对斑马鱼不进行任何处理；模型处理组，该组中对斑马鱼水溶给药2.5μg/mL的普纳替尼；治疗剂处理组，该组中对斑马鱼水溶给药2.5μg/mL的普纳替尼和不同浓度的治疗剂；各实验组均加入相同体积的养殖用水，在相同温度下恒温培养；

当普纳替尼处理斑马鱼至实验终点后，在各实验组中加入邻联茴香胺染色液，对染色处理后的斑马鱼脑部位置拍照并保存，统计脑卒中发生率，以评价该治疗剂对脑卒中的保护作用。

7.根据权利要求6所述的用斑马鱼缺血性脑卒中模型筛选或评价脑卒中治疗剂的方法，其特征在于，当普纳替尼处理斑马鱼至实验终点后，或将实验组斑马鱼置于心跳血流分析系统，分析斑马鱼脑部供血量和血流速度，计算脑部供血量(O)改善作用和血流速度(V)改善作用，以评价该治疗剂对脑卒中的保护作用，计算公式如下：

8.根据权利要求6所述的用斑马鱼缺血性脑卒中模型筛选或评价脑卒中治疗剂的方法，其特征在于，当普纳替尼处理斑马鱼至实验终点后，或将实验组斑马鱼移至带溶液的微孔板中，用运动功能分析仪分析斑马鱼运动距离(D)，计算运动功能改善作用，以评价该治疗剂对脑卒中的保护作用，计算公式如下：

9.根据权利要求6所述的用斑马鱼缺血性脑卒中模型筛选或评价脑卒中治疗剂的方法，其特征在于，当普纳替尼处理斑马鱼至实验终点后，或将实验组斑马鱼置于荧光显微镜下观察拍照，统计斑马鱼卵黄囊中的中性粒细胞数目(N)，计算抗炎作用，以评价该治疗剂对脑卒中的保护作用，计算公式如下：