[发明专利]一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法

权利要求书

1.一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，包含如下步骤：人体脂肪干细胞的提取步骤和人体脂肪干细胞的培养扩增步骤；

人体脂肪干细胞的提取通过包含如下步骤的方法实现：将人脂肪组织置于入离心分离装置中，再加入生理盐水置完全浸没后充分搅拌均匀，使用离心装置分离人体脂肪组织，得上层油层、中层脂肪层、下层沉积层；将中层脂肪层置于离心分离装置中，添加等体积的人脂肪消化液混合均匀，离心分离后去浮游脂肪并取上层液体，再向上层液体中加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液，然后离心，取下层沉积细胞，使用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2次，下层沉积细胞即为人体脂肪干细胞；将下层沉积层置于离心分离装置中，加入等体积的人脂肪消化液混合均匀，离心后的下层沉积细胞即为人脂肪干细胞；最后将中层脂肪层得到的人体脂肪干细胞与下层沉积层得到的人体脂肪干细胞合并；

所述的人脂肪消化液包含：0.3~0.8 mg/ml胆酸、0.5~1.5 mg/ml甘氨酸、0.5~2.5 mg/ml α1-抗胰蛋白酶、3~25μl/ml二甲基亚砜、175~220mg/mL 0.9% 生理盐水、60~85 mg/ml氯化镁、10~30mg/mL氯化胆碱、2.5~7.5mg/mlTrypsin-EDTA；

人体脂肪干细胞的培养扩增通过包含如下步骤的方法实现：取第13~16代传代人脂肪干细胞以1.5×10⁴/cm²的密度接种于含DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，先在DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，35~38℃下，5~7%CO2培养10~15小时；然后更换脂肪干细胞培养基，35~38℃下，5~7% CO2继续培养30~35小时；得扩增后的人体脂肪干细胞；

所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、8~20μg/ml甲状腺素、5~10μg/ml胰岛素、8~12mmol/L谷氨酰胺、100~300ng/ml葡萄酸铁、10~25mg/ml硒酸钠、5~18mg/ml维生素C、20~30mg/ml成纤维细胞生长因子、5~13mg/ml L-脯氨酸、0.5~4.5mg/ml氯化胆碱、1~2mg/ml青霉素。

2.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.5~0.7 mg/ml胆酸、0.8~1.2 mg/ml甘氨酸、1~2 mg/ml α1-抗胰蛋白酶、10~18μl/ml二甲基亚砜、200~210mg/mL 0.9%生理盐水、70~80 mg/ml氯化镁、15~25 mg/mL氯化胆碱、4~6mg/ml Trypsin-EDTA。

3.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.6 mg/ml胆酸、1 mg/ml甘氨酸、1.5mg/ml α1-抗胰蛋白酶、15μl/ml二甲基亚砜、205 mg/mL 0.9%生理盐水、75 mg/ml氯化镁、20 mg/mL氯化胆碱、5 mg/ml Trypsin-EDTA。

4.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、12~16μg/ml甲状腺素、6~9μg/ml胰岛素、9~11mmol/L谷氨酰胺、150~250ng/ml葡萄酸铁、15~20mg/ml硒酸钠、10~15mg/ml维生素C、22~28mg/ml成纤维细胞生长因子、7~10mg/ml L-脯氨酸、1~3.5mg/ml氯化胆碱、1.2~1.8mg/ml青霉素。

5.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、14μg/ml甲状腺素、8μg/ml胰岛素、10 mmol/L谷氨酰胺、200 ng/ml葡萄酸铁、18mg/ml硒酸钠、12mg/ml维生素C、25mg/ml成纤维细胞生长因子、9mg/ml L-脯氨酸、2.5mg/ml氯化胆碱、1.5 mg/ml青霉素。