[发明专利]多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法

权利要求书

1.一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，所述多糖蛋白结合疫苗是以破伤风类毒素或CRM197蛋白为载体的疫苗，所述破伤风类毒素为甲醛脱毒的破伤风蛋白，其特征在于：包括以下步骤：

（1）标准品的酶解：取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；

（2）固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；

（3）高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；

（4）绘制标准曲线：各特征肽段峰的峰面积与特征肽段的浓度呈线性关系，各特征肽段的浓度与蛋白溶液的浓度相同；配制不同浓度的破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，通过步骤（1）、（2）、（3）得到不同蛋白浓度下的各特征肽段峰的峰面积，绘制各特征肽段所对应的特征肽段浓度-特征肽段峰面积曲线，得到标准工作曲线方程通式：A=aC+b，其中，A为特征肽段峰面积，C为特征肽段的浓度，a和b为常数；

（5）样品检测：取待检测的多糖蛋白结合疫苗样品溶液，进行步骤（1）、（2）、（3），得各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；

（6）计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式如下：

多糖结合位点N的多糖结合率W%=（样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度-特征肽段N的浓度）/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度 × 100%；

多糖结合位点N的蛋白残留率C%=特征肽段N的浓度/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度 × 100%；

N代表某一特征肽段；数值最小的C%作为该样品中残留蛋白率。

2.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体操作如下：

①取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂，60℃孵育15分钟；

②加入二硫键断裂试剂，60℃反应60分钟；

③冷却至室温，加入碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；

④加入胰蛋白酶，或：加入胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液，37℃反应4～20小时；

⑤加入甲酸、乙酸或三氟乙酸，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。

3.根据权利要求1或2所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述蛋白变性剂选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠、RapiGest^TM；

或/和：所述二硫键断裂试剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦；

或/和：所述碘代乙酰胺溶液的浓度为10 mmol/L～2 mol/L。

4.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（2）中，固定相选自聚合物基质或硅胶基质的弱阴离子交换固定相WAX、聚合物基质或硅胶基质的强阴离子交换固定相SAX、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合弱阴离子交换固定相C18WAX、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合强阴离子交换固定相C18SAX、聚合物基质或硅胶基质的八烷基混合弱阴离子交换固定相C8WAX、聚合物基质或硅胶基质的八烷基混合强阴离子交换固定相C8SAX；

流动相为酸液-有机溶剂混合液；

所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸；

所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇、丙酮中的任意一种或两种以上；

或/和：所述酸液-有机溶剂混合液中，酸液与有机溶剂的体积比为1:1～1000。