[发明专利]高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法

说明书

本发明提供了一种高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌，是利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的启动子与信号肽组合与克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因aprE构建重组表达载体，并转入枯草芽孢杆菌宿主WB600中，最终电转到解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中，获得重组基因工程菌。利用该基因工程菌发酵生产的重组碱性蛋白酶的摇瓶发酵活力达到20000U/mL，是原始启动子P₄₃和信号肽SP_SacB组合的2.8倍，在5L罐放大实验，该重组菌株酶活达到60000U/mL，为实现碱性蛋白酶的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种能够高水平异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

碱性蛋白酶(Alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，它不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中,酶活性可受到二异丙基磷酰氟(DFP),苯甲基磺酰氟(PMSF)和马铃薯抑制剂(PI)等的专一性抑制。

碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。

并且芽孢杆菌具有以下优点：(1)在工业生产中，一般要求菌株对健康或环境无毒无害，芽孢杆菌中除了炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌的少数菌株外，几乎都没有致病性；(2)芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁组成简单，便于蛋白的分泌，并且不含有热源性脂多糖；(3)分子生物试验中所用的很多噬菌体和质粒都可作为其转化的工具，且重组DNA比较容易转入；(4)蛋白被直接分泌到胞外的培养基中，不会积聚，有利于蛋白的下游回收和纯化，降低整个生产链的操作成本；(5)芽孢杆菌为单细胞生物，在发酵过程中可以达到很高的细胞密度，且培养基相对比较简单，成本低、产出高，符合工业生产的要求。

启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，通过启动子的优化，来提高外源蛋白的分泌量，从而实现外源蛋白的高效表达。信号肽也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。因此，筛选启动子和最优信号肽，是介导蛋白酶基因的表达并提高碱性蛋白酶产量非常有效的方法。专利申请CN107200772A公开了一种优化角蛋白酶高校分泌表达的信号肽及其应用，此信号肽是通过对来源于枯草芽孢杆菌的三种信号肽改造获得，通过在角蛋白酶Ker的N端融合此信号肽，使重组枯草芽孢杆菌的角蛋白酶分泌效率显著提高，其胞外角蛋白酶酶活提高了3.39倍。专利申请CN104312933A公开了一种优化信号肽提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，通过与胰蛋白酶融合表达8种毕赤酵母胞外分泌信号肽，甲醇诱导启动子(pAOX)在Pichiapastoris GS115染色体上表达重组胰蛋白酶，该αmf信号肽与原始的α-factor信号肽相比，胰蛋白酶酶活提高了2.75倍，解决了胰蛋白酶胞外分泌量低的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种高效表达碱性蛋白酶的基因工程菌。本发明可以有效地提高异源碱性蛋白酶的表达量，且方法简单、操作易行、表达稳定，适用于解淀粉芽孢杆菌的表达系统。

本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：