[发明专利]基于CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因方法

说明书

本发明公开了基于CRISPR/Cas9系统在Beta‑TC‑6细胞株中剔除Sidt2基因方法，针对小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta‑TC‑6)难转染以及CRISPR/Cas9质粒分子较大的特点，通过采取电穿孔进行Cas9质粒的递送，并设置不同的穿孔电压梯度进行电转参数的优化，从而实现了在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta‑TC‑6)中高效的递送CRISPR/Cas9质粒；同时，通过将CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔相结合，克服了CRISPR/Cas9质粒难转导的特点，为常规的分子生物学实验室开展CRISPR/Cas9基因基因编辑系统提供了切实可行的办法，具有极高的推广应用价值。

技术领域

本发明涉及医疗基因工程领域，尤其涉及基于CRISPR/Cas9系统在 Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因方法。

背景技术

CRISPR/Cas9基因编辑系统成为继锌指蛋白(ZFPs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEs)之后的第三代基因编辑技术。与传统的基因编辑工具相比具有诸多的优点，首先CRISPR/Cas9基因编辑系统适应性和操作性强，来自产脓链球菌和嗜热链球菌的Cas9由于PAM识别序列仅为2个碱基(GG)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点。Cas9蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞；其次，CRISPR/Cas9 基因编辑系统简单易学，目前已有多种成熟的CRISPR/Cas9基因编辑系统质粒载体，常规的分子生物学实验室即可开展构建，只需要将长约25bp左右的sgRNA 双链连接到线性化的载体中，构建难度相对于常见的表达载体和报告基因载体小，构建完成的载体只需要通过菌落PCR或者测序即可鉴定，不必像构建表达载体担心长片段的碱基突变问题。但是CRISPR/Cas9质粒需要表达cas9蛋白相对于其他的载体偏大，一般常常在10kbp以上，转染细胞难度较大，尤其对于难转染细胞更是雪上加霜。虽然可以通过对成功转染的细胞表达的抗生素筛选或者荧光标记可进行筛选，但是转染效率低对于后续的筛选和单克隆培养造成很大的困难，并且cas9蛋白具有一定的细胞毒性，后续的抗生素筛选和流式分选也会对转染成功的细胞也会有影响。因此提高CRISPR/Cas9质粒的转染效率是急需解决的问题。

目前现有质粒转染主流的方法包括脂质体转染、阳离子非脂质体转染、磷酸钙转染等方法。这些方法有各自的优点，同时也存在着缺点。比如脂质体转染效率高，但是对于一些原代细胞或者难转染的分泌性的细胞转染效率较低。电穿孔也称为电转染，是通过高强度的电场作用，使细胞膜上形成可逆的瞬时通道，质粒在电场的作用下通过通道进入细胞内。电穿孔转染相比于其他转染方法具有操作简单、对于原代细胞和难转染细胞效率高、重复性好等优点。但是电穿孔转染对于不同的细胞系转染参数差异较大，因此需要针对不同的细胞系进行电转染参数的优化，目前比较成熟的运用电穿孔的细胞都是常见细胞系或者原代细胞，对胰岛细胞系使用电穿孔较少，也没对其进行电转染参数进行优化。另外质粒的纯度以及浓度、细胞的状态等都会对电转的效率产生影响。电转参数优化时一般在保证转染质粒纯度浓度以及细胞状态的前提下，通过固定穿孔时间，摸索不同穿孔电压梯度，以摸索细胞系最优穿孔电压。

根据上述，本发明针对小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)难转染以及 CRISPR/Cas9质粒分子较大的特点，采取电穿孔进行Cas9质粒的递送，并且设置不同的穿孔电压梯度进行电转参数的优化，从而实现了在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中高效的递送CRISPR/Cas9质粒；同时，本发明通过将 CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔相结合，克服了CRISPR/Cas9质粒难转导的特点，为常规的分子生物学实验室开展CRISPR/Cas9基因基因编辑系统提供了切实可行的办法。

发明内容