[发明专利]一种从粪菌中制备乳酸菌液的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种从粪菌中制备乳酸菌液的方法及其应用，属于生物工程技术领域；从粪菌中制备乳酸菌液的方法包括以下步骤：乳酸菌的筛选与鉴定；乳酸菌液的制备；乳酸菌的筛选与鉴定包括选择供体，通过供体粪便进行乳酸菌的培养筛选和基因测序；本发明通过选择小猪作为供体，在制备乳酸菌液时对其粪便进行筛选鉴定，降低了粪菌中有害菌存在的潜在风险；固体培养基使用香蕉泥和干柚皮粉作为培养基组分，增加了乳酸菌的生长种类及数量；液体培养基使用腐植酸钠和羧甲基纤维素钠作为培养基悬浮载体，提高了营养成分的利用效率，延长了粪乳酸菌的生长周期；制备的乳酸菌液可以在动物生长前期提前干预其肠道菌群形成来降低幼龄动物腹泻率，提高动物生长性能。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种从粪菌中制备乳酸菌液的方法。

背景技术

粪菌移植（FMT，fecal microbiota transplantation），是一种重塑肠道菌群的方法，是治疗肠道菌群紊乱导致疾病的重要手段。治疗时将健康者粪样中的功能菌群移植到患病者胃肠道内，重新组建具有正常功能的肠道菌群，从而治疗肠道及肠道外疾病。FMT在人类医学史上至少已有1700年的医学记载。中国传统医学一直有用人大小便给人治病的记载。公元300-400年间，东晋时期葛洪《肘后备急方》即有记载，用人粪清治疗食物中毒、腹泻、发热并濒临死亡的患者。现代医学史上，最早的粪菌移植报道于1958年，美国外科医生Ben Eiseman等对患有严重伪膜性肠炎的4名患者实施粪便移植，结果其中3名垂危的患者都在几天之内奇迹般康复出院了，而另1名患者死于与肠道疾病无关的其他疾病。然而，在之后的20年里，几乎没引起人重视。直至1981年，Bowden 等报道用经小肠置管输入粪液的方法，成功治愈16例伪膜性肠炎患者。2013年，FMT被纳入治疗复发性艰难梭菌感染（CDI）的指南，其治疗CDI的一次治愈率达81%。基于FMT的临床疗效，医学研究者需要反思现代生命科学某些研究思维存在的局限性，所幸的是，研究者已经从重视特定细菌开始向重视整体菌群转变，这是微生物与疾病关系研究领域在近二十年的重要认识突破。

进行粪菌移植前需要从粪菌中筛选合适的有益菌制备成可使用的乳酸菌液，现有的制备方法复杂，制备的菌液样本未经筛选，存在将致病微生物引入受体的风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从粪菌中制备乳酸菌液的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种从粪菌中制备乳酸菌液的方法，包括以下步骤：

步骤一、乳酸菌的筛选与鉴定；

步骤二、乳酸菌液的制备；

所述筛选与鉴定包括以下步骤：

（1）选择健康供体；

（2）取供体粪便，加入无菌生理盐水密封，放入摇床使其充分混匀，然后取自然沉淀上清液加入到装有固体培养基的平板中，采用平板倾注法培养乳酸菌，待凝结后倒置放入厌氧培养箱中培养；

（3）选取总数为100-300个菌落，并且具有3-5个类似乳酸菌菌落的平板，用接种环将类似乳酸菌菌落接种到三角瓶中，在厌氧培养箱中静止培养后取每个菌株培养液送检进行16S rRNA基因测序，然后确定乳酸菌的种类。

作为本发明进一步的方案：所述步骤（1）中供体为60日龄的猪，该猪饲养过程中从未得过细菌病、病毒病及寄生虫病，从未腹泻，未使用抗生素。

作为本发明进一步的方案：所述步骤（2）中取供体粪便，加入粪便重量2倍的无菌生理盐水进行密封，放入35-40℃摇床，在150-200rpm的摇床中摇晃5-15min，使其充分混匀，然后取1ml自然沉淀上清液加入到装有固体培养基的平板中，采用平板倾注法培养乳酸菌，待凝结后倒置放入35-40℃厌氧培养箱中培养40-50h。