[发明专利]一种禽流感与禽腺病毒4型二联基因工程亚单位疫苗及其制备方法

说明书

本发明属于兽用生物制品技术领域，公开了一种禽流感与禽腺病毒4型二联基因工程亚单位疫苗，所述的疫苗中的抗原为融合抗原；所述的融合抗原具有：a)禽流感病毒HA蛋白；b)禽腺病毒fiber2蛋白；c)位于所述的禽流感病毒HA蛋白和禽腺病毒fiber2蛋白之间的特异性连接肽；所述的特异性连接肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本疫苗中含有融合抗原，该融合能够诱导家禽产生高水平的特异性抗体，保护家禽免受禽流感和禽腺病毒的感染，同时本发明还公开了该疫苗的制备方法。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及禽流感与禽腺病毒4型二联基因工程亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus AIV)是禽类及一些哺乳动物的呼吸系统的重要病原，在分类学上属于正粘病毒科流感病毒属。根据表面的蛋白抗原性不同，禽流感病毒被分为17种亚型血凝素(HA)和10种亚型神经氨酸酶(NA)，其中，H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛流行，引起蛋鸡产蛋量显著下降，饲料报酬降低等，给养禽业造成了巨大的经济损失，并且对人类健康造成危险。流感病毒对宿主的致病性是由多个基因决定的，其中HA基因及其编码的蛋白尤为重要，在病毒吸附及穿膜过程中起着关键作用，是重要的表面抗原，它刺激机体产生中和抗体，可中和病毒的感染。

禽腺病毒(FAV)呈世界性分布，血清型众多，该病毒引起的肉鸡心包积水综合症就是由禽腺病毒-C血清4型腺病毒感染引起，全国各地对于该病均有报道，3～5周龄肉鸡发病尤为危害，严重时死亡率突然上升至80％以上，严重危害我国养禽业健康发展。

目前针对以上两种对家禽养殖业危害极大的疫病，疫苗防控是最有效的方式。然而在现有技术中，利用鸡胚繁殖病毒制备禽流感疫苗的生产过程中涉及活病毒操作，会对环境的生物安全产生威胁。同时在禽流感流行时由于受到鸡胚供应的限制，疫苗生产存在生产周期长和产量低等缺点。而禽腺病毒则不易培养，难以获得高滴度的病毒，尤其是不同分离株差异较大，导致制备的疫苗往往难以提供理想的免疫效果。

基于上述问题，采用基因工程发酵的方式是克服上述问题的可选手段，申请人青岛易邦生物工程有限公司于2017年申请了一项专利申请CN201710674039.5，其公开了一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是新城疫Lasota病毒株,保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒株、由法氏囊VP2蛋白和氨基酸序列为SEQ ID NO:2的禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白。

所以基于基因工程发酵进行抗原的生产是现在广泛的、正在被本领域技术人员广泛研究的一项生物技术。

在禽流感和腺病毒二联疫苗中，现在普遍采用的方法将禽流感病毒液、腺病毒病毒液作为混合抗原生产二联疫苗，如申请人青岛易邦生物工程有限公司于2016年申请了一项专利申请CN201610099573.3，其公开了一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗，本发明的疫苗所使用的H9亚型禽流感病毒QDY株和I群4型禽腺病毒YBAV-4株新毒株的TCID50/EID50效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型及禽腺病毒病各地方分离毒的攻击。其制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品的单苗相比较，二联苗无明显差异，均稳定有效；效力试验结果证明，二联苗和二种单苗抗体均保持高水平，比同类产品产生抗体快，而对照组抗体为阴性。

但是，上述的方案存在的问题在于：单独生产禽流感病毒和腺病毒，其工艺步骤多；如果基于基因工程的原理进行亚单位疫苗的制备，虽然可以简化工艺步骤，但是如何筛选得到有效的抗原决定簇，特别同时筛选出两个有效的抗原决定簇是一个问题。

更进一步的问题在于：即使筛选出了两个或多个有效的抗原决定簇，如何提高其在亚单位疫苗中的表现效果也是一个非常困难的现实性问题。

发明内容