[发明专利]利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法

权利要求书

1.本发明提供一株利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。包括以下步骤：

(1)本发明所选宿主菌株为食品安全级微生物谷氨酸棒杆菌；

(2)本发明首先通过对甘油转运蛋白基因glpF，甘油脱氢酶基因dhaD，二羟丙酮激酶基因dhaK进行核糖体结合位点(RBS)随机突变，获得能够高效利用甘油的菌株；

(3)在(2)获得的菌株的基础上，过表达巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶基因gad，并选取不同表达强度RBS序列来表达gad基因，获得最有利于积累γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶；

(4)在(3)获得的菌株的基础上，通过减少α-酮戊二酸的合成同时选取不同表达强度RBS表达序列来过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，提高前体L-谷氨酸的水平，获得最利于γ-氨基丁酸的重组菌株；

(5)在(4)获得的菌株的基础上，通过较少γ-氨基丁酸的降解，同时过表达γ-氨基丁酸转运蛋白，促进γ-氨基丁酸的合成。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于：本研究所述微生物为谷氨酸棒杆菌。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于：提高菌株甘油利用的方法包括对甘油转运蛋白基因glpF，甘油脱氢酶基因dhaD，二羟丙酮激酶基因dhaK进行核糖体结合位点(RBS)随机突变。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于：过表达巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶基因gad，再通过比较不同强度RBS表达谷氨酸脱羧酶基因gad，比较γ-氨基丁酸产量的变化，包括高强度RBS表达和低强度RBS表达，其中高强度RBS表达谷氨酸脱羧酶基因gad最利于γ-氨基丁酸的合成。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于：通过提高L-谷氨酸水平提高γ-氨基丁酸产量，包括敲除丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶基因pknG，不同强度RBS过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，促进前体物L-谷氨酸的积累。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于：通过敲除γ-氨基丁酸氨基转移酶基因gabT，琥珀酸-半醛脱氢酶基因gabD，γ-氨基丁酸转运蛋白基因gabP，较少胞内γ-氨基丁酸的降解，同时过表达γ-氨基丁酸转运蛋白基因gadC，促进γ-氨基丁酸的外排。

7.权利要求1中所得到的谷氨酸棒杆菌工程菌株发酵生产γ-氨基丁酸，其特征在于：将单菌落接到3mL LBHIS液体培养基中过夜培养，然后取1mL菌液转接至含有20mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养12-14h。然后转接至含有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，起始OD₆₀₀为1.0。发酵条件为30℃，200rpm。种子培养基为：葡萄糖25g/L，发酵专用玉米粉30g/L，尿素8g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.31g/L，MgSO₄·7H₂O 0.41g/L，pH为7.0。发酵培养基为：甘油60g/L，发酵专用玉米浆粉3g/L，尿素8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.29g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.82g/L，CaCO₃ 10g/L作为发酵培养基的缓冲剂，pH为7.0。