[发明专利]油酸水合酶及其在10-羟基硬脂酸与10-羰基硬脂酸合成中的应用

说明书

本发明涉及来源于嗜氨副球菌的油酸水合酶及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，其重组酶及制备方法，以及该重组酶作为催化剂在制备10‑羟基硬脂酸和10‑羰基硬脂酸的应用。与现有技术相比，应用本发明的油酸水合酶催化制备10‑羟基硬脂酸和10‑羰基硬脂酸，具有反应条件温和，产物浓度高，操作简便，反应时间短，易于放大等显著优势，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)来源的重组油酸水合酶，表达所述油酸水合酶的基因及其重组表达载体和重组表达转化体，该重组油酸水合酶的制备方法，以及利用该油酸水合酶作为催化剂催化制备10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸的应用。

背景技术

传统化工产业以石油、天然气、煤炭等石化资源作为原料和能源，石化资源的大量消耗，造成了资源短缺以及全球气候变暖等严重问题，为缓解现有的这些问题，利用资源丰富、可再生的生物质资源，通过生物技术生产生物基燃料、材料和化学品的理念受到了广泛关注。

油酸作为一种不饱和脂肪酸，是油脂类生物质的重要组成成分，资源非常丰富。以油酸作为出发原料，可以通过酶法转化制备10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸，这两种长链脂肪酸衍生物可以作为润滑剂、表面活性剂以及聚酯合成的原料；10-羰基硬脂酸还可以进一步通过酶法裂解制备癸二酸、羟基癸酸、癸醇、辛醇等中链脂肪族功能化学品。

目前脂肪酸(包括油酸)的酶法催化转化研究主要集中在转化途径的建立和高活力酶的挖掘。2012年，Joo等从嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)中挖掘获得一个脂肪酸水合酶，使用重组表达该酶的大肠杆菌整细胞催化油酸水合转化为10-羟基硬脂酸，底物浓度为50g/L，整细胞催化剂用量为10g/L，反应4h，转化率为92％，时空产率为295g/L/d(J.Biotechnol.,2012,158(1-2):17-23)。2013年，Park课题组开发了一条多酶整细胞催化油酸转化、裂解的途径，其中脂肪酸水合酶催化的油酸水合反应是这条途径的第一步，也是比较关键的限速步骤。这条途径给脂肪酸的催化转化提供了新的方向，然而这条途径的底物上载量仅为1mM，转化率为60％(Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52(9):2534-2537)，存在着油酸水合酶催化活性低、底物上载量低，反应时间长以及转化率低等问题。2015年，Lee等人在谷氨酸棒状杆菌中共表达了油酸水合酶和10-羟基硬脂酸脱氢酶，利用整细胞催化油酸一步转化生成10-羰基硬脂酸。该反应的底物上载量为2.5g/L(8.8mM)，整细胞催化剂的上载量为5g/L，反应6h后，转化率仅有78％，时空产率仅为16.5g/L/d(Biotechnol.Lett.,2015,37(5):1101-1106)。

对于油酸水合酶催化生产10-羟基硬脂酸以及油酸水合酶和10-羟基硬脂酸脱氢酶的级联催化生产10-羰基硬脂酸的反应，前人的研究都存在底物上载量低，转化率低的现象，主要原因是现有的油酸水合酶的活力偏低，因此需要筛选高活力的油酸水合酶，在此基础上优化10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸合成的催化反应体系，以达到更优的反应效果。

发明内容

针对目前已报道的油酸水合酶活力低下，催化反应时空产率低的缺陷，本发明提供了一种具有高活性的油酸水合酶，表达所述油酸水合酶的基因及其重组表达载体和重组表达转化体，所述油酸水合酶的制备方法及其在合成10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一：提供了一种高活性的油酸水合酶。