[发明专利]一种利用RNase H检测(CAG)n重复序列的方法

说明书

本发明公开了一种利用RNase H检测(CAG)n重复序列的方法，属于分子生物学技术领域。本发明的方法通过(CAG)n与荧光素标记的互补RNA适配体混合；限制性核酸内切酶RNase H的酶切反应：(CAG)n与适配体的混合溶液中与限制性核酸内切酶RNase H溶液混匀、孵育；荧光检测：经酶切反应的溶液加入氧化石墨烯，混匀、孵育，得到待检测溶液，用荧光分光光度计检测荧光强度。本发明方法操作简单、检测快速且灵敏度高，对含(CAG)n的检出限达1.12×10^‑10mol/L，本发明检测含(CAG)n的DNA序列具有非常高的特异性。

技术领域

本发明涉及一种利用RNase H检测(CAG)n重复序列的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

亨廷顿舞蹈症等神经性疾病是一种以影响运动功能为主的神经退行性疾病。其病理改变主要是纹状体中等大小多棘神经元的退行性病变，尤以纹状体投射性γ-氨基丁酸神经元的死亡最为严重。该突变基因位于人第4号染色体上，在外显子起始密码子ATG下游第17个密码子处有一段三核苷酸CAG的重复序列，亨廷顿舞蹈症即由该基因中CAG重复序列的异常扩展突变引起的，而且该重复的序列也被视为该疾病检测的生物标志物。

现有检测CAG序列的重复状况的方法，有采用的是通过纳米金-DNA传感器或是石墨烯氧化物-DNA传感器，这两种方法操作简单，检测时间较短。但这两种方法存在多种缺陷，比如目标DNA因不能重复利用，所带出的荧光基团较少不易被检测出，并且造成了检测精度不佳、过度浪费等问题。

发明内容

本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种利用核糖核酸内切酶RNase H的特异性，借助氧化石墨烯-RNA传感器，检测导致亨廷顿舞蹈症的(CAG)n重复序列的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种检测(CAG)n重复序列的方法，所述方法利用核糖核酸内切酶RNase H检测导致亨廷顿舞蹈症的(CAG)n重复序列，其包括如下步骤：

(1)待测(CAG)n样品与适配体结合：将待测(CAG)n样品与荧光素标记的互补RNA适配体溶液混匀；

(2)核糖核酸内切酶RNase H的酶切反应：向步骤(1)的混合溶液中加入核糖核酸内切酶RNase H溶液，以及Buffer溶液混匀、孵育；

(3)荧光检测：向经过步骤(2)酶切反应的混合溶液中加入氧化石墨烯，混匀、孵育，得到待检测溶液，用荧光分光光度计检测荧光强度，获得(CAG)n浓度与荧光强度的线性回归方程，作为(CAG)n定量分析的标准曲线。

在本发明的一种实施方式中，所述n＝6～15，且n为整数。

在本发明的一种实施方式中，所述(CAG)n重复序列的n＝10。

在本发明的一种实施方式中，所述(CAG)n的DNA的核苷酸序列为5’-CAG CAG CAGCAG CAG CAG CAG CAG CAG-3’，所述RNA适配体的核苷酸序列为5’-FAM-GUC GUC GUC GUCGUC GUC GUC GUC GUC GUC-3’。

在本发明的一种实施方式中，所述荧光素标记的RNA适配体溶液的浓度为2.0×10^-7mol/L，所述荧光素标记的互补RNA适配体溶液是将所述荧光素标记的核酸适配体溶液于1.9～2.1×10^-2mol/L Tris中。

在本发明的一种实施方式中，所述荧光素包括5-羧基荧光素。