[发明专利]用于乙肝病毒感染的重组巨细胞病毒与应用

说明书

本发明提供了用于乙肝病毒感染的重组巨细胞病毒，所述重组巨细胞病毒能表达乙型肝炎病毒表面抗原，所述重组巨细胞病毒通过细菌人工染色体诱变产生，所述乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。该重组巨细胞病毒可表达HBV表面抗原的完整复制及缺陷型复制；在HBV小鼠复制模型中证实了表达HBV表面抗原的重组巨细胞病毒载体乙肝疫苗抗HBV的免疫功效；初步阐明了表达HBV表面抗原的重组巨细胞病毒载体乙肝疫苗抗HBV的免疫功效的免疫机制。为寻找治愈乙肝的治疗性药物提供了新的理论与实践基础，在临床应用上有重要意义。

技术领域

本发明涉及病毒学、免疫学和医学技术领域，特别涉及预防和治疗乙肝病毒感染的重组巨细胞病毒与应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的公共卫生问题，慢性HBV感染在我国尤为严重。虽然全球范围内推广实行婴儿和新生儿接种HBV预防性疫苗后已经大大减少了新发感染病例,但是慢性感染人群依然无法得到彻底治疗。预防性疫苗是控制HBV发病不可或缺的一部分，但是我们更需要新的药物或者治疗性疫苗治愈已经感染HBV的人群以减少HBV及其相关疾病所引起的死亡。

急性自限性HBV感染的患者体内会自发出现针对HBV核心(即核衣壳)、聚合酶和表面(即包膜)蛋白的多克隆和多特异性辅助性T细胞以及细胞毒性的T细胞应答，而这些细胞应答在慢性HBV感染患者中出现功能障碍，反应很弱甚至检测不到。所以针对慢性HBV新的治疗性药物或者疫苗应该与特异性免疫应答特别是T细胞反应相结合，才能有效地治愈HBV。CMV作为载体的疫苗在联合特异性T细胞反应方面具有强大潜能，能够大幅度增强CD8+T细胞的免疫优势，可能实现在个体中建立保护性CD8+T细胞应答的目标。而HBV感染后特异性免疫激活与否决定着感染的最终结局，当机体免疫系统未能及时控制HBV感染时就会进展为慢性感染，此时CD8+T细胞存在功能耗竭，病毒特异性CD8+T细胞功能耗竭是HBV病毒持续复制的关键因素之一。

细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromsomes，BAC)，是一种基因诱变工具，具有转座效率高、负载容量大、宿主特异性差等特点。BAC用于维持和修饰大肠杆菌中不同来源的大序列。除基于RecA的穿梭诱变外，Red重组通常用于序列修饰。由于外源序列，如抗生素抗性基因以及frt-或loxP-位点在突变体BAC克隆中通常是不需要的，现有的一种技术允许无斑点生成点突变、缺失和插入较小的和更大的序列。该方法采用序列复制，其在第一次重组步骤中插入靶序列，并通过体内I-SceI切割和第二次Red重组切除选择标记。为了在不使用额外质粒的情况下进行方便和高效的诱变，产生了具有染色体编码的可诱导的Red-和I-SceI-表达的大肠杆菌菌株。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于乙肝病毒感染的重组巨细胞病毒。

用于乙肝病毒感染的重组巨细胞病毒，所述重组巨细胞病毒能表达乙型肝炎病毒表面抗原，所述重组巨细胞病毒通过细菌人工染色体诱变产生，所述乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述细菌人工染色体诱变将在启动子的控制下的乙型肝炎病毒表面抗原基因替换为巨细胞病毒中的m157或m27基因座。

进一步地，所述启动子为真核EF1启动子。

本发明还有另一个目的在于提供上述制备预防乙肝病毒感染的疫苗中的应用。

本发明的还有一个目的在于提供上述重组巨细胞病毒在制备治疗慢性乙肝病毒感染的疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：构建了可表达HBV表面抗原的完整复制及复制缺陷型小鼠巨细胞病毒载体乙肝疫苗；并在HBV小鼠复制模型中证实了表达HBV表面抗原的重组巨细胞病毒载体乙肝疫苗打破慢性HBV耐受、抗HBV复制的免疫功效；初步阐明了表达HBV表面抗原的重组巨细胞病毒载体乙肝疫苗抗HBV的免疫功效的免疫机制。该发现为寻找治愈乙肝的治疗性药物提供了新的理论与实践基础，在临床应用上有重要意义。