[发明专利]一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测组试剂盒和对照组试剂盒两种成分，所述检测组试剂盒包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK‑N‑SH和ELISA检测试剂盒，所述对照组试剂盒包括空白对照细胞系Neo/SK‑N‑SH和ELISA检测试剂盒。本发明可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题，快速、高效、精准、高通量的检测各种样品中的大麻素类活性物质。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

对于吸毒人员吸食大麻类毒品的检测和监管一直是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗四氢大麻抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但大麻类在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成大麻素层出不穷，且分子结构多样，使基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也无法检测。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。

本发明构思为：无论是天然大麻素，还是各种各样的合成大麻素，其在机体内都会作用到大麻素受体这个靶点，从而产生其生物学效应。大麻素受体至少包括CB1、CB2两种类型，CB1主要存在于中枢神经系统中。大麻素受体属于GPCR类，当受到大麻素类分子激动剂作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号使内质网内储存的Ca²⁺迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答，如神经细胞释放多巴胺。由于多巴胺的测定有成熟的ELISA检测试剂盒，因而我们通过建立稳转CB1的神经母细胞瘤细胞系CB1/SK-N-SH，建立一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质检测方法，应用于快速、高效、精准、高通量的检测各种样品中的大麻素类活性物质。

所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建真核表达pCMV-CB1质粒；

2）将步骤1）pCMV-CB1质粒转染到神经母细胞瘤细胞，并建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到检测组细胞培养液；同时以慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo为对照空载体，建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到对照组细胞培养液；

3）步骤2）检测组细胞培养液中加入四氢大麻酚并充分反应，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的标准液；将标准液离心分离后，取上清液并用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD值，以测得的吸光度OD值为纵坐标，以标准液中的四氢大麻酚浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；

4）步骤2）检测组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的检测组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD₁值；步骤2）对照组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的对照组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD₂值；计算吸光度OD₁值与吸光度OD₂值之差，并带入步骤3）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质的效应含量。

所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞。