[发明专利]一种利用甲醇还原NAD类似物的方法

说明书

本发明公开了一种利用甲醇还原NAD类似物的方法及其应用。该方法中还原剂为甲醇，催化剂为可利用甲醇的甲醇脱氢酶，甲醇脱氢酶氧化甲醇的同时，将NAD类似物转化为其还原态。该方法可用于生产还原态NAD类似物或氘代的还原态类似物，也可为消耗还原态NAD类似物的酶促反应提供还原态辅酶，还原态的NAD类似物可作为辅酶应用于苹果酸酶ME‑L310R/Q401C、D‑乳酸脱氢酶DLDH‑V152R、酿酒酵母醇脱氢酶等酶催化的还原反应，有利于NAD类似物的广泛应用。该NAD类似物还原方法可在温和条件下，再生还原态NAD类似物用于苹果酸或乳酸的制备；也可作为一种氧化还原力调控微生物体内苹果酸或乳酸的代谢强度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物的酶催化还原方法及其应用，具体地说，是以甲醇为还原剂，在酶催化下将NAD类似物转化为其还原态，并可被其他酶用做辅酶应用于还原反应。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态NADH是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的一系列氧化还原代谢及其他的重要生物化学过程。这些辅酶可用于生产手性化学品及制备同位素标记物。由于很多氧化还原酶都利用NADH或NADPH作为辅酶，任何改变NAD浓度及其氧化还原状态的操作都会对细胞产生全局性影响，很难在辅酶水平对生物体系中特定的氧化还原酶进行控制。由于NADH可被代谢网络中的多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。使用NAD类似物传递还原力时，由于类似物只能被突变型氧化还原酶识别，从而在辅酶水平对目标氧化还原过程进行调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；Wang L,et al.ACSCatal，2017,7,1977-1983)。

目前已经报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)、烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)(Ji DB,et al.JAm Chem Soc,2011,133,20857-20862；Ji DB,etal.Sci China Chem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Genbank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，GenbankCAA68326)L6R突变体。

利用NAD类似物及识别它们的酶，可以构建更经济有效的生物催化体系(纪德彬等.催化学报,2012,33,530-535)。通过选择合适的NAD类似物及识别它们的酶，可利用粗酶液进行反应达到纯酶催化的效果，实现在辅酶水平控制复杂生物催化转化体系。目前，已经实现利用NAD类似物进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，DLDH-V152R可利用NCD将丙酮酸还原为乳酸，实现了特异性的生物催化调控(Wang L,et al.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。

和使用其他氧化还原辅酶一样，NAD类似物也必需再生循环。辅酶再生方式主要有酶法、电化学法、化学法和光化学法。其中酶法具有选择性高、可以与合成酶兼容及高转换数等优点。甲醇脱氢酶可以利用甲醇，将甲醇转化成甲醛，在微生物细胞中甲醛可以通过细胞内源的甲醛脱氢酶催化，转化成甲酸或者进入核糖酮单磷酸途径、四氢甲烷蝶呤途径等，产生细胞生命活动必须的代谢物和还原力，从而实现一碳资源的有效利用(Müller JE,etal.Metab Eng,2015,28,190-201；Zhang W,et al.RSC Adv,2017,7,4083–4091)。