[发明专利]一种CAR-T细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种CAR‑T细胞的制备方法，其包括：采集供者的外周血单个核细胞；分选出CD3+T淋巴细胞，并进行激活培养；将带有目的基因的慢病毒载体感染激活的T淋巴细胞，并在转染时添加了一定比例的DMSO；转染后换液，并继续对转染后的T细胞进行扩增培养，获得CAR‑T细胞终产品。本发明在病毒载体转染步骤中，添加适量的DMSO，显著地降低了病毒转染所需的MOI，从而降低病毒的用量，提高了CAR‑T细胞的转染效率，大大降低了制备成本。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种CAR-T细胞的制备方法。

背景技术

CAR-T技术，即Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。目前在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

CART细胞制备的一般过程，包括从富含免疫细胞的血样采集，T细胞的分选与激活，T细胞的转染，T细胞的扩增，最终制剂的制备。其中，将目标基因转导进入T细胞的转染过程，大多采用慢病毒(Lentivirus)感染的方式。由于慢病毒性状的特点，稳定、可靠、大量的慢病毒制备现在是CAR-T细胞制备领域的一项瓶颈。

如何能显著降低T细胞制备病毒转染过程中病毒的用量，从而提升制备效率、显著降低CAR-T细胞生产成本，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种CAR-T细胞的制备方法，通过降低感染时的MOI(multiplicity of infection，感染复数)方式，大大降低病毒载体的用量，由此显著提升T细胞感染后的CAR的表达比例。大大降低了CAR-T细胞制备过程中，病毒载体制备的压力，节省了制备成本。

本发明的目的是这样实现的：

本发明的一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)采集供者的外周血单个核细胞；

2)从步骤1)采集的外周血单个核细胞中分选出CD3+T淋巴细胞；

3)对分选得到的CD3+T淋巴细胞进行激活培养，培养温度为37℃，CO₂浓度为5％；

4)将带有目的基因的慢病毒载体感染经过步骤3)激活培养后的T淋巴细胞，转染时的培养温度为37℃，CO₂浓度为5％，且转染时在培养基中按照每100ml培养基添加0.1-5ml的比例添加DMSO；

5)对经步骤4)转染后的T淋巴细胞进行扩增培养，培养温度为37℃，CO₂浓度为5％，获得CAR-T细胞终产品。

上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤2)中分选后的CD3+T淋巴细胞含量需达到5.0-10×10⁶/kg以上。

上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤3)中T淋巴细胞激活培养24-36小时后进行所述步骤4)。

上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤4)转染时，T淋巴细胞的密度控制在10-100万细胞/ml。

上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤4)病毒感染的时间为18-36小时。

上述的一种CAR-T细胞的制备方法，其中，步骤5)所述回输要求为T细胞比例不低于60％，CAR-T细胞比例不低于2％。

本发明在CAR-T细胞制备过程中，将目的CAR基因转导到T细胞时，在转导培养基中添加一定量的DMSO，通过降低感染时的MOI方式，大大降低病毒载体的用量。