[发明专利]一种降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程和生物制药技术领域，具体公开了一种降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用，将Aglycin通过自剪切内含肽、连接肽与自组装肽进行连接，构建能在体外自剪切的重组表达载体，将重组表达载体在大肠杆菌体内表达，获得重组表达菌株；重组表达菌株加入诱导剂进行诱导表达，离心收集菌体，对菌体进行破碎离心后得到沉淀，经诱导剂切割并离心得到上清，然后对切割后上清进行纯化，获得高纯度Aglycin。本发明首次通过基因工程的方法实现了Aglycin的可溶性表达，并且多肽具有一定α‑葡萄糖苷酶抑制的降糖活性，可用于制备降糖多肽药物。

技术领域

本发明属于基因工程和生物制药技术领域，具体涉及一种基于自组装肽和自剪切肽的降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用。

背景技术

迄今为止，糖尿病(diabetes mellitus，DM)已经成为威胁人类生命健康的隐性杀手之一，据国际糖尿病联盟(IDF)公开发布的报告显示，2017年全球超过4.25亿人患上糖尿病，其中我国患者数量占全球的25％以上，高达1.14亿(母义明,贾伟平.中国糖尿病研究进展专辑简介[J].中国科学:生命科学,2018,48(08):807-809)。糖尿病是由多种因素引起的代谢紊乱综合症，其中Ⅱ型糖尿病患者占糖尿病总人数的90％以上(Xu Y,Wang L M,He J,et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA,2013,310(9):948-958)。Ⅱ型糖尿病患者长时间的高血糖会引发各种慢性并发症，如脑血管病变、心脏病、肾功能衰竭、眼病、皮肤病、足部溃疡、性病等等。据统计，每年至少需要1000亿美元来对糖尿病及其相关并发症进行治疗(Jarald E,Joshi S B,Jain D C.Diabetes andherbal medicines[J].Iran J Pharmacol Ther,2008,7(1):97-106)。临床上使用的降糖药物的药效有限且存在毒副作用，长期服用容易导致皮肤过敏、肝肾功能损伤、胃肠道不适等，因此开发能调节糖代谢的生物活性肽成为国内外研究的热点。

Aglycin又称为胰安肽，是从大豆或豌豆种子中提取分离的、由37个氨基酸残基组成的新型生物活性肽，其含有三对分子内二硫键。经初步的生理功能研究，Aglycin有一定调节糖代谢与保护胰腺β细胞的能力。

目前，Aglycin主要通过大豆或豌豆种子的提取分离来制备，其提取分离的效率低下且过程十分繁琐，需要经过乙酸提取、海藻酸吸附、葡聚糖G-25凝胶过滤、离子交换层析、反相高效液相色谱制备等多个步骤。而用基因工程的生物方法来制备Aglycin并研究其应用，无疑具有重大的理论和现实意义。

大肠杆菌由于其遗传背景清晰、繁殖旺盛、表达量高、产物易纯化和成本低等优点，成为发展最早和迄今为止应用最广泛的原核表达系统。Aglycin具有三对分子内二硫键且分子量较小，因此研究其在大肠杆菌原核体系的可溶性表达具有较高的理论意义和经济效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种真核生物多肽在原核生物大肠杆菌中的可溶性表达，第一次用基因工程的方法实现了Aglycin的重组表达，并且初步验证了重组Aglycin对α-葡萄糖苷酶抑制的降糖活性。

本发明通过分子生物学的方法和技术实现了Aglycin在大肠杆菌体内的功能性表达。一方面，基于自组装肽ELK16能在大肠杆菌细胞内进行自聚集的特性，将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接，构建能在体外自剪切的高效表达载体。另一方面，通过内含肽在一定条件下的自剪切特性，大大减少了目的多肽的损失,使目的多肽达到高效表达的效果，最终纯化获得具有降糖活性的Aglycin。

本发明所采取的技术方案如下：