[发明专利]用于为目标蛋白量身构建最优的枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法

说明书

本发明属生物高技术领域，公开了一种用于为目标蛋白量身构建最适的枯草杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法。每个重组蛋白都有其独特的最优蛋白酶缺失突变表达宿主，而现有的枯草杆菌胞外蛋白酶缺失宿主适用性差，不能满足这种个性化需求。鉴于此，本发明提供一种用于为重组蛋白量身定制最适胞外蛋白酶缺失表达宿主的方法。该方法能准确评估枯草杆菌的每种胞外蛋白酶对目标蛋白生产的影响，从而确定有利和有害的胞外蛋白酶，然后通过失活不利的蛋白酶、保留有利的蛋白酶，获得最优宿主，以最大化提高目标蛋白的产量。

技术领域

本发明属于生物高技术领域，公开了用于为目标蛋白量身构建最适的枯草杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法。

背景技术

枯草杆菌(Bacillus subtilis)是一个重要的重组蛋白表达宿主。该宿主具有安全性好、蛋白分泌能力强以及发酵培养成本低等优点。另一方面，该宿主也有些缺点，其中之一就是该菌分泌八种胞外蛋白酶，包括两种中性蛋白酶(NprE和NprB)，三种丝氨酸蛋白酶(Epr、Bpr和Vpr)，碱性蛋白酶AprE，金属蛋白酶Mpr和细胞壁蛋白酶WprA，这些蛋白酶会降解分泌细胞外的重组蛋白，降低其产量。解决该问题的直接办法是敲除这些蛋白酶的编码基因。目前已报道的蛋白酶缺失突变菌株有1A751(失活了NprE和AprE)(Microbiology,1995,doi:10.1099/13500872-141-2-281),WB600(失活了NprE、AprE、Epr、Bpr、Mpr和NprB)(J Bacteriol,1991,doi:10.1128/jb.173.16.4952-4958.1991),WB700(失活了NprE、AprE、Epr、Bpr、Mpr、NprB和Vpr)和WB800(失活了NprE、AprE、Epr、Bpr、Mpr、NprB、Vpr和WprA)(J Bacteriol,2002,doi:10.1128/JB.184.1.76-81.2002)。这些突变株有较低的胞外蛋白酶活性，在重组蛋白生产上优于它们的野生菌株。

然而，当研究者要在枯草杆菌中分泌表达一个蛋白时，首先要思考该选择哪个蛋白酶缺失宿主，1A751、WB600、WB700还是WB800？现实情况是没有选择标准，只能在这些宿主中碰运气。比如，普鲁兰酶在WB600(失活6个胞外蛋白酶)中的分泌量是其在WB800(失活8个胞外蛋白酶)中分泌量的三倍(Protein Expr Purif,2016，doi：10.1016/j.pep.2016.04.008)；1A751和WB700被分别用于高效分泌葡萄糖激酶和β-甘露聚糖酶(Biotechnol Bioeng,1999,doi:10.1002/(SICI)1097-0290(19990105)62:1<87::AID-BIT10>3.0.CO；2-I；J Agric Food Chem,2017,doi:10.1021/acs.jafc.6b05528)。这些结果说明两个问题：一，不是所有八个胞外蛋白酶对所有重组蛋白的表达都是有害的；二，某个胞外蛋白酶可能对蛋白A的生产是有利的，但对蛋白B的生产却是有害的，即有益或有害胞外蛋白酶的种类是随着目标重组蛋白的变化而变化的。这意味着每个重组蛋白都有其独特的最优蛋白酶缺失突变宿主；显然，现有的蛋白酶缺失突变宿主(1A751、600、700和800)并不能满足这种个性化的需求。要为目标重组蛋白量身定制最优的胞外蛋白酶突变宿主，首先要确定对该重组蛋白有益和有害的胞外蛋白酶，但目前尚无解决这一问题的方法。

发明内容

技术问题：每个重组蛋白都有其独特的最优蛋白酶缺失突变表达宿主，而现有的枯草杆菌胞外蛋白酶缺失宿主适用性差，不能满足这种个性化需求。鉴于此，本发明提供一种用于为重组蛋白量身定制最适胞外蛋白酶缺失表达宿主的系统及方法(图1)。该方法能准确评估枯草杆菌每种胞外蛋白酶(共八种)对目标蛋白生产的影响，从而确定有利和有害的胞外蛋白酶，然后通过失活不利于外源蛋白分泌的蛋白酶同时保留有利的蛋白酶，从而获得最优宿主，以最大化提高目标蛋白的产量。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：