[发明专利]一种醇脱氢酶及其制备醇的应用

说明书

本发明公开了一种醇脱氢酶，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。而且还公开了该醇脱氢酶在以醛为底物合成醇的反应中的应用。该新型重组醇脱氢酶在大肠杆菌表达体系中具有高效的可溶性表达能力，且该重组醇脱氢酶在醛还原反应体系中合成醇的转化率为90％左右。

技术领域

本发明属于基因工程领域。特别地，本发明涉及将醛(特别是呋喃醛)还原为醇的脱氢酶，及涉及编码这种脱氢酶的多核苷酸及其在醛至醇的生物转化中的应用。

背景技术

醇(特别是呋喃醇)是一种重要的用途广泛的有机化工原料，可由相应的醛通过催化加氢制得，工业上加氢还原分为液相加氢和气相加氢两种工艺。液相加氢法又分高压法和中压法，高压法多在9.8MPa以上操作，温度控制在170-200℃之间，用三氧化二铬和氧化铜做催化剂，转化率在95-100％之间，中压法多在6.73-6.86MPa左右操作，温度控制在160-170℃左右，也用三氧化二铬和氧化铅作为催化剂，所得产物在66.5-79.84kPa减压精馏得到目标产物，转化率一般为80-90％。气相加氢法在0.1-0.39MPa下进行，温度控制在80-170℃左右，用镍或铬-铜系催化剂。传统的催化加氢工艺需要在高温高压下进行，存在较大的危险性，并且生产装置的投资成本高。

醇脱氢酶广泛存在于动植物和微生物体内，虽然醇脱氢酶容易获得，且大多数性质稳定，大都是通过多重筛选、显色法、基于辅酶衍生物的筛选方法、基于辅酶荧光的筛选方法，基于以上方法获得耐受醛的醇脱氢酶比较困难。

另外，在利用醇脱氢酶合成醇的反应过程中，过高浓度的醇会抑制反应的进一步进行，使反应向正向移动的速度变得缓慢，导致产物的产率较低。为了减少产物的抑制，利用酶反应热力学和动力学原理，加大底物的浓度，采用两相反应体系，能够使底物缓慢释放到水中，而生成的大量产物被抽提到有机相，促使反应向呋喃醇合成的方向进行，可以提高还原反应的得率。与在水溶液中进行的酶催化反应相比，酶在两相中进行催化反应有如下优越性：①有利于疏水性底物的反应；②酶不溶于有机溶剂，容易回收再利用；③能提高酶的稳定性，可扩大反应的适应范围；④可控制底物的专一性；⑤没有微生物污染。因此，获得能够耐耐受醛和有机溶剂中的醇脱氢酶显得尤为重要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人通过提取生物质酸水解设备附近土壤的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接到克隆载体pUC19上，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态，建立宏基因组文库，通过涂布含抑制浓度醛平板高通量筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。

本发明人进一步测试了筛选到的耐受高浓度醛的醇脱氢酶的有机溶剂耐受性，发现该酶能够耐受甲基叔丁醚、异丙醚、二氯甲烷、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇，特别是水、甲基叔丁醚和乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸丁酯。因此，筛选的醇脱氢酶非常适用于利用呋喃醛合成高浓度呋喃醇的反应。接下来，本发明在20％(v/v)甲基叔丁醚的溶剂体系中、常温常压条件下、1,4-丁二醇做为氢供体，利用醇脱氢酶催化还原呋喃醛制备相应的醇，摩尔转化率达到90％以上，转化浓度达到800mM，提供了一条呋喃醇的安全和绿色化制备工艺。

因而，本发明提供以下各项：

1.一种醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码根据以上1所述的醇脱氢酶的核苷酸序列，优选其如SEQ ID NO.1所示。

3.融合多肽，其包含根据以上1所述的醇脱氢酶并且具有醇脱氢酶活性。

4.一种克隆醇脱氢酶基因(优选根据以上1所述的醇脱氢酶)的宏基因组学方法，所述方法包括以下步骤：

a.提取生物质酸水解设备附近(例如，土壤)的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经酶切(优选BamHI酶切)后连接到克隆载体(如pUC19)上，获得重组克隆载体；