[发明专利]一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法

权利要求书

1.一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、胶原基质的制备：将无菌、具有生物活性且未变性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原或复合型胶原加入至无菌管中，向其中加入在4℃下预冷的低糖DMEM培养基，在4℃温度下经充分混合后，静置备用；

S2、间充质干细胞的制备：选取状态良好的人间充质干细胞按1×10⁷个细胞/cm²的浓度悬浮至诱导培养基中得到细胞悬液；

S3、骨髓的制备：将新鲜骨髓用5倍量的生理盐水悬浮，离心弃去上清液，将下层骨髓沉淀用生理盐水充分悬浮，即得骨髓悬液备用；

S4、半成品组织工程骨的培养制备：向步骤S2中得到的细胞悬液中加入步骤S1中得到的胶原基质，充分混合后，将其移入至透析袋中，固定透析袋，用注射针头纵向穿透，在穿孔处插入管式半透膜进行组装；组装完毕后将透析袋放入培养器皿中，加入足量的低糖DMEM诱导培养基，浸没所有组织，向培养器皿中注入管式半透膜，并吸取诱导培养基，以驱赶气泡；随后将培养器皿置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中培养，48小时后缓慢吸去培养上清液，然后加入新鲜的低糖DMEM诱导培养基继续培养，每48小时更换一次新鲜的诱导培养液，连续培养10天，得到半成品组织工程骨；

S5、具有再生能力的组织工程骨的培养制备：将步骤S4中的培养器皿中的透析袋去除，将透析袋中的管式半透膜抽出，并加步骤S3中得到的骨髓悬液注入至管式半透膜抽出后留下的孔洞处，然后将透析袋置于培养器皿中，加入含有10％血清替代品的低糖DMEM诱导培养基浸没组织，并于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中继续培养24小时，随后去除外侧透析袋，即得可移植使用的具有再生能力的组织工程骨。

2.根据权利要求1所述的具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，透析袋的长度与所需组织工程骨的长度相匹配，透析袋直径为8mm，透析袋截流分子量为1000KD，管式半透膜直径为5mm。

3.根据权利要求1所述的具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，诱导培养基为含有谷氨酰胺、抗坏血酸、丙酮酸钠、地塞米松、β-甘油磷酸钠、血清替代品的低糖DMEM培养基。

4.根据权利要求1所述的具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中人间充质干细胞选自于骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、脐带或羊膜。

5.根据权利要求1所述的具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中新鲜骨髓为采用EDTA抗凝抽取人、大鼠或小鼠的骨髓。