[发明专利]一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用

说明书

一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用。本发明提供了一组用于多交叉置换恒温扩增引物的核苷酸分子组合，还提供了所述的核苷酸分子组合用于多交叉置换恒温扩增检测纹带棒状杆菌种特异性基因ftr1的方法。本发明提供的核苷酸分子组合在以多交叉置换恒温扩增检测纹带棒状杆菌种特异性基因ftr1时具有高度的特异性，可以将纹带棒状杆菌与其他密切相近的菌种鉴别出来，而且所述方法具有高度的灵敏度，检测下限为10fg的基因组DNA。

技术领域

本发明涉及多交叉置换扩增在细菌检测中的应用，特别是在纹带棒状杆菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum,C.striatum)是一种革兰氏染色阳性，无芽孢，非运动性的短棒状杆菌，通常定殖于人的皮肤和黏膜表面，被认为是一种机会致病菌。然而近几年，由纹带棒状杆菌导致的医院病例甚至暴发逐渐增多。该菌可导致人的肺炎、心内膜炎和败血症等疾病，尤其容易感染患慢性疾病的以及免疫功能低下的患者。一般来说，住院时间长、接受过介入性治疗或长期使用抗生素的患者更容易被其感染。此外，值得注意的是，这种新发的医院感染病原菌多为多重耐药性菌株，因此为临床治疗带来了很大的困难。

目前临床微生物实验室鉴定棒状杆菌属细菌，单纯用痰涂片镜检及生化试验很难将其精确地鉴定到种水平，因此还需要借助其他方法，例如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MOLDI-TOF MS)和16S rRNA基因测序等。然而这些方法较为昂贵和费时费力，且需要基于细菌的分离培养。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术被用于棒状杆菌的鉴定。Carolina S.Santos等建立了一个普通PCR体系可用于鉴定纹带棒杆菌，其检测的目标靶基因为纹带棒杆菌的种特异基因ftr1，该基因在鉴定时能将纹带棒杆菌与无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)和干燥棒杆菌(Corynebacteriumxerosis)有效地区分开，显示出100％的敏感性和100％的特异性，表明ftr1基因对纹带棒杆菌具有良好的特异性，可作为鉴定纹带棒杆菌的可靠靶基因。然而该方法仍然依赖于繁杂的实验仪器和设备，且需要通过凝胶电泳进行结果的判读，这无疑增加了鉴定的时间和经济成本。此外，PCR检测技术的灵敏度相对较低，因此在应用到临床标本的检验时可能会出现漏检，不利于快速诊断和应急检测。因此，亟需发展一种简单、快速、灵敏、高效的诊断技术用于纹带棒杆菌的快速检测。

多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplification,MCDA)技术是由叶长芸等建立的一种新的恒温核酸扩增技术(CN104946744A)，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高的特点。该技术目前已被广泛用于生物相关领域，实现核酸的快速扩增及分子诊断分析。MCDA针对靶序列设计5对引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，靶序列能够得以高效扩增。MCDA扩增之后，三种主流的检测方法被用于MCDA扩增判读，即可视染料检测、电泳检测和实时浊度检测。

鉴于诸如痰涂片镜检、生化试验等方法将棒状杆菌属鉴定到种水平的困难性和偏差性，以及MOLDI-TOF MS和16S rRNA基因测序等方法存在的检测时间长、受限因素多等缺点，应用MCDA方法进行纹带棒状杆菌的快速诊断成为亟需解决的技术需求。本发明的目的就是提供一种能够用于恒温扩增检测纹带棒状杆菌的核苷酸分子引物的组合，以及能够方便、高效、快速地检测纹带棒状杆菌的基因扩增方法。

发明内容