[发明专利]一种用于公鸡精液中禽白血病病毒分离的处理液及制备方法

说明书

本发明公开一种用于公鸡精液中白血病病毒分离的处理液及制备方法。所述的处理液主要成分为：8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、1.44g/L磷酸氢二钠、0.24g/L磷酸二氢钾、500～1000kU/L青霉素、0.5～1g/L链霉素、1～2mg/L两性霉素B、10～15mg/L恩诺沙星。所述上述试剂依次加入溶剂瓶，加入蒸馏水溶解、混匀、定容，将溶液用0.22um滤膜过滤除菌后低温保存。使用时将公鸡精液和处理液按1:4的比例混匀后4℃环境下孵育30min，8000r/min离心5分钟取上清接种细胞，用于禽白血病病毒分离。使用本处理液可有效减少公鸡精液接种细胞造成的污染，增加病毒分离的成功率，有利于禽白血病病毒的检测。

技术领域

本发明属于动物疫病诊断技术领域，具体涉及公鸡精液中禽白血病毒检测所需的公鸡精液处理液的制备方法。

技术背景

禽白血病是由禽白血病病毒（ALV）引起的以免疫抑制和多发性肿瘤为特征的病毒性传染病，该病自国外传入到我国后在鸡群中的感染日趋严重，我国绝大部分鸡种中均有该病的报道，每年造成的经济损失达200亿元，严重危害我国养鸡业的健康发展。针对ALV感染的特点和我国鸡群的感染现状，目前防控ALV最有效的方法是进行种鸡群的净化，使用DF-1细胞分离ALV检测方法已在国外种禽ALV净化中得到成功的应用，该方法利用DF-1细胞对内源性ALV抗性的特点，可从血浆、精液、蛋清等组织中分离检测出外源性ALV，也被视为ALV检测的金标准。由于在种鸡生产中种公鸡和母鸡通常按1:10～20比例进行授精，若公鸡精液中存在ALV的感染，不仅会通过授精传播给母鸡，造成感染的人为放大效应，还会通过种蛋垂直传播给下一代，造成巨大的经济损失，因此种公鸡的精液中ALV检测具有重要的生产意义。

在利用DF-1细胞检测鸡群ALV感染中，血浆、蛋清等样品在采集时均可做到无菌操作，在接种细胞时无需进行特别的处理。但是由于在公鸡精液采集过程中不可避免的会有泄殖腔或环境中微生物的污染，这些污染的微生物包括细菌、支原体和霉菌等。以前常规使用精液原液或生理盐水处理后接种DF-1细胞，但往往由于精液蛋白浓度过高或细胞污染等原因导致检测失。

发明内容

为了解决公鸡精液作为细胞接种样品分离ALV时的微生物污染导致的检测失败、由于检测失败造成的ALV传播风险增加和重检劳动量增加的问题，本发明提供一种用于公鸡精液中禽白血病病毒分离的处理液及制备方法。

一种用于公鸡精液中禽白血病病毒分离的处理液由8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、1.44g/L磷酸氢二钠、0.24g/L磷酸二氢钾、500～1000kU/L青霉素、0.5～1g/L链霉素、1～2mg/L两性霉素B和10～15mg/L恩诺沙星制成；

所述处理液的pH值为7.0～7.4；

当用于公鸡精液中禽白血病病毒分离时，按体积比1:4将公鸡精液和所述处理液充分混合；在温度4℃条件下孵育30min；在转速8000r/min条件离心5min，取离心上清液接种DF-1细胞，培养9天，实现禽白血病病毒分离。

进一步限定技术方案如下：

取100uL离心上清液接种24孔细胞板中的一孔细胞中，每孔含细胞培养液600uL，DF-1细胞2×10⁵个，在温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体（CO₂）的培养箱中孵育3小时，用浓度0.01M 的PBS缓冲液润洗细胞一遍，加入细胞维持液600uL，继续维持培养9天。

一种用于公鸡精液中禽白血病病毒分离的处理液的制备操作步骤如下：

（1）制备第一混合液

将氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g溶解于850mL蒸馏水中，混合均匀，用浓度1mol/L 盐酸（HCL） 调节第一混合液的pH值至7.0～7.4，得到第一混合液；

（2）制备第二混合液