[发明专利]陆地棉基因组的精确高效编辑方法

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及陆地棉基因组的精确高效编辑方法。本发明对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ载体进行改造，以LbCpf1蛋白取代原有的Cas9蛋白，构建在棉花中具有编辑能力的载体GhRBE3。选取GhCLA为目标基因验证GhRBE3在棉花中的应用。设计1个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将Cpf1基因编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行Sanger测序和高通量测序，检测本发明在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率及脱靶效应。本发明具有良好的编辑效率和特异性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种陆地棉基因组的精确高效编辑方法。本发明包括构建陆地棉的高效转化载体，利用构建的载体在陆地棉功能基因组中进行精准编辑。

背景技术

CRISPR/Cas系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromicrepeats/CRISPR- associated protein)是细菌和古菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断迚化而来的一种获得性免疫防御机制。CRISPR/Cas9系统是目前应用最多最广泛的基因编辑系统，能够高效特异和灵活的识别靶基因中的特定位点，然而，随着研究的不断深入，CRISPR/Cas9也暴露了比较严重的脱靶效应(Hsu et al 2014)、PAM序列的限制导致其切割位点较少，基因编辑后后代不易纯合等缺陷。因此需要改造CRISPR/Cas9系统，降低其脱靶效应，提高基因编辑精准度，扩大靶标位点范围，寻找新的基因编辑系统。

Cpf1核酸酶来自毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium ND2006)，由1228个氨基酸组成。与CRISPR/Cas9不同的是，CRISPR/Cpf1核酸酶的PAM序列基序为5'-TTTV-3'，具备“T/A”富集区的PAM识别位点；向导RNA是结构简单的单一的crRNA分子，不需要tracrRNA参与编辑过程；切割位点发生在目标链PAM区下游23核苷酸处和非目标链18核苷酸处，使 DNA双链断裂，产生粘性末端(Zetsche et al 2015)，除此之外，Cpf1的切割位点离PAM基序较远，允许先前已经突变的序列被反复切断，促进了同源重组修复(HDR)的产生。从而可以实现更简单，精准的基因组定向遗传修饰。张勇等研究团队构建了Cpf1核酸酶植物基因组编辑新系统构，并对其PAM识别位点进行了精确界定，实现了Cpf1核酸酶介导的水稻基因组有效编辑。同时，构建了LbCpf1核酸酶的RR及RVR变体表达系统，在水稻基因组中成功实现了以多种PAM位点的编辑，拓展了Cpf1可编辑位点数量，有效推进了 Cpf1核酸酶在植物基因组编辑中的应用。

目前，Cpf1核酸酶编辑系统在很多物种中被报道，但是在异源四倍体棉花中尚无报道。陆地棉是一种广泛种植的异源四倍体(AtDt)，其基因组中的许多基因具有高度同源性，并且基因组比较复杂及庞大，传统的CRISPR-Cas9系统在需要对某些特定基因进行编辑及功能分析时无能为力。本发明的碱基编辑系统作为可行而又有效的精准编辑工具，为棉花基因组功能分析，作物遗传改良和新品种选育提供重要技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种陆地棉基因组的精准高效编辑方法，特别是构建一种适用于陆地棉的碱基编辑系统。本发明基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ(Xie et al 2015,Wanget al 2018) 和pHUN611(安徽省农业科学院水稻研究所魏鹏程老师课题组提供)载体，构建了融合 LbCpf1核酸酶的适用于棉花遗传转化系统的碱基编辑系统(即载体GhRBE3)。

本发明技术方案如下所述：

一种能够精确识别基因组“-TTTV-”碱基并能产生黏性末端的编辑陆地棉基因组高效转化载体GhRBE3，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

一种能够精确识别基因组“-TTTV-”碱基并能产生黏性末端的编辑陆地棉基因组高效转化载体GhRBE3，该载体通过下列步骤制备获得：