[发明专利]一种金属硫蛋白基因MT20、其编码得到的金属硫蛋白及其表达和应用

说明书

本发明公开了一种金属硫蛋白基因MT20，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，来源于土壤微生物，含有该金属硫蛋白基因的微生物重金属耐受性好，在1.0M浓度镉溶液中仍然可以存活生长。并且对镉金属富集效应明显，因而在重金属污染治理等行业具有较大的应用潜力。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种金属硫蛋白基因、其编码得到的金属硫蛋白及其表达和应用。

背景技术

金属硫蛋白(metallothionein，简称MT)是一类普遍存在于生物体内的金属结合蛋白。金属硫蛋白是具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质。富含半胱氨酸的短肽，对多种重金属有高度亲和性。它是分子质量较低，半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。

重金属生物修复是利用生物材料进行重金属治理的技术，而重金属抗性基因是生物修复的重要资源。基于基因改造的生物材料可以突破自然生物材料的性状限制，获得生物量、生长速度和修复效率的优化组合，来自微生物的重金属抗性基因已经在高效修复生物材料的开发方面显示出巨大的潜力。早在1998年，Nature Biotechnology（Rugh et al.,1998）就报道了稳定表达细菌汞还原基因merA 的黄杨（yellow poplar，又译作鹅掌楸），该转基因植物展示了一种生态友好的植物修复途径。来自沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）的砷甲基化基因arsM 最近被用于了构建基因工程菌，该工程菌展示了高效修复砷污染土壤的潜力（Chen et al., 2014）。少数研究也展示了基因改造生物材料在镉污染修复上的潜力。例如，Shim 等人将酵母的镉抗性基因YCF1 转入杨树，促进了该植株在镉污染土壤中的生长，也增强了该植株的镉富集能力（Shim et al.,2013）；Kang 等人将三个微生物镉抗性基因SpPCS、GshI和MntA 转入大肠杆菌，使转基因菌株的镉富集能力提高了25 倍（Kang et al.,2007）。

现阶段对于重金属耐受/富集效果的金属硫蛋白来源往往来自于动物、植物，对微生物来源的金属硫蛋白研究较少。

发明内容

本发明的目的在于获得一种重金属耐受/富集效果的金属硫蛋白基因，从而得到由其编码的金属硫蛋白，进而将其应用于重金属污染治理领域中。

本发明第一方面是提供一种，金属硫蛋白基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，由该基因编码得到的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过以下步骤分离得到上述金属硫蛋白基因：

S1. 用铜溶液污染土壤，避光恒温25度培养14天

S2. 使用商用DNA提取试剂盒提取土壤全基因组

S3. 使用二代Illumia测序平台HiSeq对基因组进行全测序

S4. 通过通用生物信息学方法对测序序列进行质检、过滤、组装

S5. 从公开基因数据库UniProt和GenBank中搜索所有有关的金属硫蛋白基因序列

S6. 手动检查所述金属硫蛋白基因序列可靠性，编号后将可靠金属硫蛋白基因序列汇总，经软件翻译形成金属硫蛋白氨基酸序列数据库，所述金属硫蛋白氨基酸序列数据库见SEQ ID NO：3 ~SEQ ID NO：54；

S7. 利用生物信息学检索方法BLAST，在测序组装的土壤基因组中搜索可能的金属硫蛋白基因序列，以所述金属硫蛋白氨基酸序列数据库作为检索模板

S8. 获得的所述可能的金属硫蛋白基因序列进行手动检查，核对序列的核苷酸偏好性、金属结合位点等信息，进一步确定高可靠性的金属硫蛋白基因序列

S9. 功能验证